农杆菌介导β-1，3-葡聚糖酶（BG2）基因转化南瓜的研究

论文摘要

南瓜营养丰富、用途广泛,具有较高的食用价值和经济价值。黑龙江省籽用南瓜栽培面积年达到300万亩,是国内外重要的籽用南瓜产区。南瓜籽也是黑龙江省农产品出口创汇产品之一。南瓜真菌病害的危害极大降低了南瓜的产量和品质。南瓜疫病造成死秧烂瓜,个别多雨年份病害大流行可造成局部地区绝产。南瓜白粉病造成植株早衰而降低产量和影响籽粒饱满度。常规抗病育种方法在南瓜的品种改良、选育等方面发挥了重要作用,但存在选育年限长、耗资大、效率低及抗性种质资源匮乏等问题。近年来以导入目的基因创造新种质的基因工程手段的应用,为南瓜抗真菌病育种的选育开辟了一条新途径。本试验以金辉一号南瓜为试材,建立了南瓜高频再生体系,通过农杆菌介导将抗真菌病基因β-1,3-葡聚糖酶（BG2）基因导入金辉一号南瓜中,并探讨了影响其再生体系和遗传转化效率的主要因素,确定了金辉一号南瓜最佳再生和遗传转化条件,为培育南瓜抗真菌病新品种奠定了基础。研究的主要内容和结果如下:（1）建立了金辉一号南瓜再生体系:最佳无菌苗萌发培养基为0.8%琼脂,接种方式为平放;最佳外植体来源为“两片子叶呈直立状态,颜色为绿色”的无菌苗;最佳外植体为1/2子叶节;最佳不定芽分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA,芽伸长培养基为MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L GA3;最佳生根培养基为MS+0.1mg/L NAA。（2）确定了抗生素筛选浓度:载体上含有NPTⅡ选择标记基因,使转化植株带有卡那霉素抗性,本试验进行两次筛选,确定芽分化阶段卡那霉素筛选浓度为100mg/L。（3）确定了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、AS添加浓度五个因素对遗传转化的影响:最佳组合为:预培养36h+OD600（0.30.5）侵染10min+共培养2d（培养基中添加100 mg/LAS）（4）对得到的抗性植株进行PCR检测和Southern杂交检测,获得5株阳性植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 本研究的目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 植物抗真菌基因工程研究进展
• 1.2.2 β-1,3-葡聚糖酶基因研究进展
• 1.2.3 南瓜属作物再生体系研究进展与应用
• 1.2.4 农杆菌介导瓜类作物遗传转化研究进展
• 1.3 本研究的主要内容
• 2. 试验材料与方法
• 2.1 南瓜再生体系的优化
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 南瓜遗传转化体系的建立
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 转基因植株的分子生物学检测
• 2.3.1 试验材料
• 2.3.2 试验方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 南瓜植株再生体系的建立
• 3.1.1 不同处理方式对南瓜无菌苗萌发的影响
• 3.1.2 不同培养基对无菌苗萌发的影响
• 3.1.3 胚接种方式对无菌苗萌发的影响
• 3.1.4 不定芽的诱导
• 3.1.5 不定芽的伸长
• 3.1.6 生根培养基的筛选
• 3.1.7 再生植株的驯化移栽
• 3.2 南瓜遗传转化体系的建立
• 3.2.1 卡那霉素选择压的确定
• 3.2.2 遗传转化的主要影响因素分析
• 3.3 转基因植株的分子生物学检测
• 3.3.1 转基因植株的PCR 检测结果
• 3.3.2 转基因植株的Southern 杂交检测结果
• 4. 讨论
• 4.1 南瓜再生体系的影响因素
• 4.1.1 外植体选择
• 4.1.2 激素种类与浓度的选择
• 4.2 遗传转化的影响因素
• 4.2.1 抗生素的选择与使用
• 4.2.2 农杆菌菌液浓度与侵染时间
• 4.2.3 预培养与共培养
• 4.2.4 乙酰丁香酮的加入方式
• 4.3 转基因植株的检测
• 4.4 本试验的创新点
• 4.5 今后研究方向与展望
• 5. 结论
• 5.1 无菌苗的获得
• 5.2 南瓜高频再生体系的优化
• 5.3 南瓜遗传转化体系的建立
• 5.4 转基因植株的分子生物学鉴定
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表学术论文