非小细胞肺癌细胞株ASPP1和ASPP2表达的检测

论文摘要

本实验以非小细胞肺癌（NSCLC）系细胞株NCI-H157和A549为研究对象,将两株细胞进行相应处理后,测定其ASPP（p53促凋亡蛋白,Apoptosis stimulating protein of p53）家族成员ASPP1和ASPP2的蛋白质和mRNA表达,以期为肿瘤的治疗和检测提供新的分子靶点。背景与目的:p53基因是一种广谱的肿瘤抑制基因,定位于人类1 7号染色体短臂1区3带。大量研究表明p53基因在许多肿瘤中都有很高的突变率,是迄今为止发现的突变频率最高、涉及范围最广的抑癌基因之一[1,2]。其编码产物p53蛋白为肿瘤抑制蛋白,本质是一种核磷酸蛋白,以转录因子形式调节相关基因表达,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡[3]。ASPP家族是英国科学家发现的能刺激p53凋亡功能的蛋白质家族,其成员包括ASPP1,ASPP2,iASPP（inhibitory member of the ASPP family）[4,5],该家族的共同特点是:含有SH3结构域、大量的锚蛋白、丰富的谷氨基结构域。许多研究证实,在肿瘤的发生、发展中ASPP家族成员能与p53共同作用,是p53的关键调节蛋白,其中ASPP1,ASPP2促进p53的细胞凋亡功能,而iASPP抑制p53的细胞凋亡功能。ASPP家族与p53作用总的机制是:ASPP与p53结合形成ASPP-p53复合物作用于原凋亡基因启动子,ASPP的微小变化就可引起p53结合DNA的能力发生改变,从而影响p53诱导凋亡的能力。细胞根据p53蛋白与停滞基因结合或与凋亡基因结合的活力大小做出是细胞停滞还是细胞凋亡的决定。iASPP则可能是与ASPP1和ASPP2竞争与p53的结合位点,影响ASPP-p53复合物与DNA结合的能力,从而阻止p53的细胞凋亡功能[6]。对野生型p53乳腺癌的ASPPI和ASPP2的mRNA表达研究发现,有60%的肿瘤ASPP1表达水平下降,23%的肿瘤ASPP2表达水平下降,且在这23%的肿瘤中有90%的ASPP1表达水平下降;研究8例野生型p53和ASPP水平正常的乳腺癌患者的iASPP含量,结果发现7例患者的iASPP含量都比较高。LOSSOS等[7]对弥漫性大B淋巴细胞瘤和滤泡性淋巴瘤等进行研究,发现ASPP2表达高的患者存活时间长,而ASPP2表达低的患者存活时间短。张云[8]等的研究发现,人淋巴瘤细胞株jurkat和正常人血液单核细胞中均有ASPP2基因的mRNA表达,正常人单核细胞中ASPP2基因的mRNA表达量比jurkat细胞株的ASPP2基因的mRNA表达量高。张新伟[9]等检测iASPP在急性白血病细胞中的表达,发现与正常人及CR期AL患者相比,初发AL患者细胞存在iASPP显著高表达。这些研究表明ASPP1,ASPP2在多种肿瘤细胞中表达显著降低,而iASPP的表达显著升高。而且,ASPP1和ASPP2表达降低的肿瘤细胞对化疗药物和紫外线照射敏感性也较低,提示通过增强ASPP1,ASPP2的表达,抑制iASPP的表达,促进p53的抑癌功能,可能是肿瘤治疗的一个新的策略和方向。本实验目的旨在检测非小细胞肺癌细胞株A549（ p53野生型）和NCI-H157（p53突变型）中ASPP1和ASPP2的mRNA和蛋白表达,对比P53遗传背景不同的NSCLC细胞株中ASPP家族的表达情况;探讨2株细胞对顺铂的敏感性以及比较顺铂（CDDP）处理后2株细胞的凋亡情况。方法:1.通过实时荧光定量PCR准确检测非小细胞肺癌细胞株A549（p53野生型）和NCI-H157（p53突变型）中ASPP1和ASPP2的mRNA表达,对比p53遗传背景不同的NSCLC细胞株中ASPP家族的表达情况;2.应用Western Blot实验比较在2株细胞中ASPP1和ASPP2蛋白质表达情况;3.应用MTT实验（甲基噻唑基四唑3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5二苯基四氮唑溴盐,商品名噻唑蓝）检测2株细胞对顺铂的敏感性以及通过流式细胞分析法检测比较顺铂处理后2株细胞的凋亡数量。结果:1.NCI-H157细胞株ASPP1, ASPP2mRNA平均表达量比A549分别高2.66倍,6.98倍（p1=0.002,p2=0.03）。2.NCI-H157细胞株ASPP1,ASPP2蛋白表达比A549高1.33倍,1.24倍。3.顺铂（CDDP）处理后NCI-H157细胞株的IC50值是3.7ug/ml,A549的IC50是10.48 ug/ml。4.CDDP处理后NCI-H157细胞株的凋亡率是12.76%, A549是4.54%。结论:ASPP1和ASPP2在突变型NSCLC细胞株中的表达比野生型细胞株中高。而且表明以下趋势:ASPP1和ASPP2表达水平和非小细胞肺癌细胞株对抗肿瘤药物的敏感性有关,有望成为肿瘤治疗和检测的新的分子靶点。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料
• （五） 方法
• （六） 结果
• （七） 统计分析
• （八） 讨论
• （九） 结论
• （十） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢