论文题目: 革耳（Panus rudis）漆酶的异源表达和酶学性质改良
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 杨建强
导师: 朱厚础,汤国营
关键词: 漆酶,改良,定点突变,易错,毕赤酵母原核表达
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 漆酶是一类含铜的多酚氧化酶,它的合成分泌存在有一系列的转译后加工过程（如糖基化等）,一般认为漆酶蛋白的异源表达是比较困难。另外,漆酶的某些性质如氧化还原电位较低,高温易失活等也阻碍了它在实际中的应用。 野生革耳是新发现的一种能生产组成型漆酶的白腐真菌,该菌产生的漆酶具有较好的热稳定性,是一种极具研究价值和开发潜力的真菌漆酶。本研究中首先利用PCR扩增的方法在野生革耳漆酶基因lcc的3′端添加了编码5个氨基酸的酵母偏爱密码子,得到了改造的野生革耳漆酶基因lccT。将基因lcc和lccT分别连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,转化毕赤酵母进行分泌表达,获得了重组野生型漆酶LCC及其突变体LCCT。通过研究不同温度和铜离子浓度对漆酶表达活性影响的结果,当诱导培养温度为20℃,培养基中CuSO4浓度为0.3 mM时漆酶的表达活性最高。在此条件下比较诱导表达的重组漆酶LCC和LCCT的活性,发现LCCT的最大酶活（192 U/L）是LCC的最大酶活（42.9 U/L）的4.5倍。这一结果表明漆酶C-端序列对其活性有较大影响。诱导表达漆酶LCCT经过分子筛和离子交换层析得到电泳纯的漆酶蛋白LCCT,pH4.5时的比活力为3.68 U/mg。根据SDS-PAGE测定的重组漆酶LCCT的表观分子量为61.6 kDa。以ABTS为底物时的最适反应pH值为2.6,最适温度为45℃。氧化ABTS的Km值为0.61 mmol/L,对应的Vmax为12.21μmol/min。重组漆酶LCCT在60℃的半衰期为8min。在50℃保温1h保留酶活71%,50℃以下保温1h保留酶活均大于80%。 为了获得高活性的漆酶,我们利用定点突变和易错PCR的方法对基因lccT进行改造。 通过定点突变,使重组漆酶LCCT中第459位上的Asp（D）突变为Glu（E）,得到的重组漆酶突变体LCCTM459纯化后的比活力在pH4.5时为8.54 U/mg。根据SDS-PAGE测定的重组漆酶LCCT459表观分子量为61.5kDa,以ABTS为底物测得最适反应pH值为3.0,最适温度45℃。氧化ABTS的Km值为0.16 mmol/L,Vmax为20.04 μmol/min。重组漆酶LCCTM459在70℃保温10min酶活完全丧失,60℃的半衰期为8min。在50℃保温1h保留酶活14%,50℃以下保温1h保留酶活均大于50%,说明在50℃以下的温度重组漆酶LCCTM459的活性相对稳定,
论文目录:
英文缩略词表
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 野生革耳漆酶工程菌株的构建及产酶条件的研究
一 材料与方法
二 结果
1 重组质粒的构建及鉴定
2 重组转化子的构建及菌落PCR鉴定
3 不同温度和不同铜离子浓度对漆酶活性的影响
三 讨论
参考文献
第二章 野生革耳漆酶在毕赤酵母中的表达纯化及部分酶学性质研究
一 材料与方法
二 结果
1 重组转化子(pPICZαA／lcc-X-33)和(pPICZαA／lccT-X-33)的诱导培养
2 重组漆酶LCCT的分离与纯化
3 漆酶的部分酶学性质
三 讨论
参考文献
第三章 野生革耳漆酶的定点突变及部分酶学性质研究
一 材料与方法
二 结果
1 重组质粒的构建及鉴定
2 转化子的构建及菌落PCR鉴定
3 转化子(pPICZαA／lccTM459-X-33)在摇瓶中的诱导培养
4 重组漆酶LCCTM459的分离与纯化
5 漆酶的部分酶学性质
三 讨论
参考文献
第四章 野生革耳漆酶基因的易错突变及高活性突变体的筛选和部分酶学性质研究
一 材料与方法
二 结果
1 用易错PCR(error-prone PCR)技术扩增出野生革耳漆酶基因lccTE
2 重组质粒pPICZαA／lccTE构建和PmeI酶切线性化
3 线性化重组质粒pPICZαA／lccTE转化酵母宿主菌以及活性表达漆酶的转化子pPICZαA／lccTE-X-33的筛选
4 转化子pPICZαA／lccTE-X-33的诱导表达
5 转化子pPICZαA／lccTE-X-33的菌落PCR与重组质粒pPMD18T／lccTE的构建
6 lccTE基因的突变结果
7 重组漆酶LCCTE的分离与纯化
8 漆酶的部分酶学性质
三 讨论
参考文献
第五章 野生革耳漆酶在大肠杆菌中的表达
一 材料与方法
二 结果
1 重组质粒pET-22b(+)／lccT的构建与酶切鉴定
2 转化子pET-22b(+)／lccT-Rosetta~(TM)的诱导和表达
3 胞质上清中的可溶性重组漆酶LCCT的孵育复性
4 不同温度条件下转化子pET-22b(+)／lccT-Rosetta~(TM)的诱导表达量
5 相同培养温度，不同孵育时间对重组漆酶复性的影响
6 一定孵育时间内，不同的培养温度对重组漆酶复性的影响
三 讨论
参考文献
总结
致谢
文献综述
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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