兴奋性神经毒素KA诱导AD小鼠大脑神经细胞凋亡的机制及阿魏酸的保护作用

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）,又称老年痴呆,是一种主要发生在老年期的原发性退行性脑部疾病,其病理特征以老年斑,神经元缺失或变性以及神经纤维缠结为主。临床上主要是以记忆力减退、认知功能障碍及神经功能异常为主要表现形式的慢性进行性疾病。随着全球人口老龄化步伐的加快,老年痴呆的发病率也呈逐年递增的趋势。如何防治老年痴呆已经成为生命科学研究的热门课题之一。目的：1.研究阿魏酸对红藻氨酸诱导的AD小鼠神经行为学的影响。2.研究阿魏酸对红藻氨酸诱导的AD小鼠脑神经细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-9表达的影响。3.探讨阿魏酸对红藻氨酸诱导的AD小鼠脑神经胶质细胞活化的影响。4.探讨阿魏酸对红藻氨酸处理的PC12细胞活性以及凋亡率的影响。方法：1.通过脑定位仪在小鼠右侧海马区注射红藻氨酸建立AD模型,并用阿魏酸连续灌胃30天。用Morris水迷宫实验检测AD小鼠神经行为学变化。2.采用免疫组织化学方法观察阿魏酸对AD小鼠脑神经细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-9表达的影响。3.采用免疫组织化学方法观察阿魏酸对AD小鼠脑神经胶质细胞活化的影响。4.应用细胞爬片免疫组化和流式细胞仪检测阿魏酸对用红藻氨酸处理的PC12细胞活性以及凋亡的影响。结果：1.小鼠海马区定位注射KA30天后,模型组小鼠绕平台所在象限穿越次数最少,其游泳轨迹杂乱,无规律变化；在定位航行实验中,模型组与假手术组相比较,随着训练天数的递增逃逸潜伏期明显延长（P＜.01）；在空间搜素实验中,模型组与假手术组相比较,随着训练天数的增加穿越平台次数明显减少（P<0.01）,穿越平台所在象限的游泳时间明显缩短（P<0.01）。阿魏酸治疗组小鼠用药30天后,绕平台所在象限穿越次数也逐渐增多；在定位航行实验中,药物组与模型组比较,随着训练天数的不断增加逃逸潜伏期明显缩短（P<0.05）；在空间搜索实验中,药物组与模型组比较穿越平台次数明显增多（P<0.05）,穿越平台所在象限的游泳时间明显延长（P<0.05）。2.免疫组化结果表明,与假手术组相比,模型组和阿魏酸治疗组其Bc1-2阳性表达明显减少；而阿魏酸高、中、低剂量药物组相比于模型组,其Bcl-2的表达也有显著性提高,表明神经细胞可通过Bcl-2的过量表达来抑制KA引起的细胞凋亡。此外模型组Bax阳性表达量相比于假手术组、阿魏酸各剂量药物组明显增高,致使Bax/Bcl-2比值明显上升,可见Bax/Bc1-2比值决定细胞存亡。另外,模型组、阿魏酸高、中、低剂量药物组中Caspase-3与Caspase-9蛋白的表达量相比于假手术组,明显升高,神经元凋亡显著增多,推测Caspase-3与Caspase-9在KA引起神经元凋亡机制中发挥重要作用。3.与假手术组相比,模型组、阿魏酸高中低各剂量药物组中GFAP的表达量明显增加,主要分布在海马CA1区和齿状回,神经胶质细胞大量活化,对神经元产生直接或间接损伤。此外,在模型组中GFAP和IL-1β的双表达量以及GFAP和TNFa的双表达量较假手术组、阿魏酸高中低剂量药物组明显增多,且对比显著,表明在胶质细胞活化的同时,细胞因子有增强兴奋性毒性的作用,参与AD致病机制。4.细胞爬片免疫组化和流式细胞仪结果显示PC12细胞经KA损伤后,与假手术组相比,模型组细胞数量明显减少,突起消失或断裂,细胞树突间联系减弱,与流式细胞仪检测的凋亡率相符合,假手术组凋亡率明显下降,而模型组细胞凋亡率显著上升。结论：1.学习记忆能力的衰退是AD发生的一个重要的行为学特征。无论从反映信息获取能力的逃逸潜伏期,还是从反映信息贮存能力的穿越平台次数和平台所在象限的游泳时间来看,阿魏酸都具有明显改善小鼠学习记忆的作用。2.神经元凋亡是AD发生的一个显著特征。治疗药物阿魏酸对KA诱导的拟AD小鼠脑神经元凋亡具有抑制作用,可能通过参与调控凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9表达而发挥作用。3.神经胶质细胞活化在AD发生过程中显著增多,表明神经细胞受到毒害,星形胶质细胞出现胶质反应而被激活,促使GFAP大量合成。与此同时,细胞因子IL-1β、TNFα参与免疫炎症反应,表达显著增多,反映大脑受损伤程度。4.KA造模后,阿魏酸能明显改善PC12细胞的活力以及形态,可减轻兴奋性神经毒素所致的神经元损伤,对神经元具有保护作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 阿魏酸对AD小鼠学习记忆的影响
• 一、材料
• 1.1 动物
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 主要仪器
• 二、方法
• 2.1 动物筛选
• 2.2 动物模型的制作
• 2.3 药物干预
• 2.4 小鼠一般行为学观察
• 2.5 水迷宫检测
• 2.6 统计分析
• 三、结果与分析
• 3.1 阿魏酸对AD小鼠游泳轨迹的影响
• 3.2 阿魏酸对AD小鼠定位航行实验的影响
• 3.3 阿魏酸对AD小鼠空间搜索实验的影响
• 四、讨论
• 第二部分 阿魏酸对AD模型小鼠大脑神经细胞凋亡的影响
• 一、材料
• 1.1 动物
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 主要仪器
• 二、方法
• 2.1 动物筛选
• 2.2 试剂的配制
• 2.3 动物模型的制作
• 2.4 药物干预
• 2.5 病理学检测
• 2.6 统计分析
• 三、结果与分析
• 3.1 AD小鼠组织切片HE染色观察
• 3.2 阿魏酸对AD小鼠Bcl-2,Bax蛋白表达的影响
• 3.3 阿魏酸对AD小鼠Caspase-3凋亡蛋白表达的影响
• 3.4 阿魏酸对AD小鼠Caspase-9凋亡蛋白表达的影响
• 四、讨论
• 第三部分 阿魏酸对AD模型小鼠大脑胶质细胞活化的影响
• 一、材料
• 1.1 动物
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 仪器
• 二、方法
• 2.1 动物筛选
• 2.2 主要试剂的配制
• 2.3 动物模型的制作
• 2.4 药物干预
• 2.5 病理学检查
• 2.6 统计分析
• 三、结果与分析
• 3.1 阿魏酸对AD小鼠脑神经元中GFAP表达的抑制作用
• 3.2 阿魏酸对AD小鼠脑神经元中GFAP与IL-1β共表达的影响
• 3.3 阿魏酸对AD小鼠脑神经元中GFAP与TNFα共表达的影响
• 四、讨论
• 第四部分 阿魏酸对PC12细胞活性及凋亡的影响
• 一、材料
• 1.1 PC12细胞
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 主要仪器
• 二、方法
• 2.1 PC12细胞的培养
• 2.2 主要试剂的配制
• 2.3 细胞模型的制作及药物处理
• 2.4 MTT检测PC12细胞存活率
• 2.5 流式细胞仪检测PC12细胞凋亡率
• 2.6 HE病理观察
• 2.7 免疫荧光
• 2.8 统计分析
• 三、结果分析
• 3.1 阿魏酸对PC12细胞存活率的影响
• 3.2 阿魏酸对PC12细胞凋亡的影响
• 3.3 PC12细胞HE染色观察
• 3.4 阿魏酸对PC12细胞中Bcl-2与Bax凋亡蛋白表达的影响
• 3.5 阿魏酸对PC12细胞中Caspase-3与Caspase-9凋亡蛋白表达的影响
• 四、讨论
• 总结
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 个人简历
• 致谢