人泡沫病毒载体的构建及其在神经系统疾病治疗中潜在的应用研究

论文题目: 人泡沫病毒载体的构建及其在神经系统疾病治疗中潜在的应用研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 刘万红

导师: 李文鑫

关键词: 人泡沫病毒载体,辅助质粒,海马神经元,星形胶质细胞,基因转移,基因治疗

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 人泡沫病毒(human foamy virus,HFV)于1971年被分离发现,是最早发现的人逆转录病毒。除了与其它逆转录录病毒一样含有5’LTR(long terminal repeats,LTR)、3’LTR和结构基因gag,pol,env以外,HFV还包含有一个位于env基因3’端的内部启动子IP(intemal promoter,IP)和四个调控基因的开放阅读框:bel1,bel2,bel3和bet(位于env基因和3’LTR之间)。HFV在人和动物细胞中有广泛的宿主范围,能感染多种类型的细胞,并且能有效的感染非分裂细胞;HFV有较大的基因组,具有转移大分子量的外源基因或多个外源基因的潜力:并且HFV不被人血清灭活;尤为重要的是HFV无明显的致病作用。因此,人泡沫病毒构建的载体被认为是一种安全有效的基因治疗载体。 本室在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHSRV13的基础上,缺失病毒基因组的env基因和bel基因,保留其内部启动子IP构建了一个表达标记基因neo和报告基因EGFP的重组人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-GFP。尽管pGPSNI-GFP提高了病毒载体的安全性,但是其不能单独产生病毒颗粒,需要辅助质粒提供病毒复制必需的结构基因才能产生有感染性的病毒颗粒。因此,我们在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHSRV13的基础上,缺失突变了gag和pol基因,并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3’LTR,构建了辅助质粒p△GP提供给复制缺陷型病毒复制所必需的结构基因。将复制缺陷型人泡沫病毒载体pGPSNI-GFP和辅助质粒p△GP分别转染以及共转染人小肠癌细胞(human intestine cell,HIC),荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI-GFP和p△GP的HIC细胞能够强烈表达绿色

论文目录:

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英文摘要

第一章 神经系统疾病的基因治疗

1.1 基因治疗的基本原理

1.2 神经系统疾病基因治疗的基础

1.3 神经系统疾病基因治疗的基本方法

1.4 神经系统疾病基因治疗的关键因素

1.5 神经系统疾病基因治疗中的治疗基因

1.5.1 癫痫基因治疗中的治疗基因

1.5.2 帕金森病基因治疗中的治疗基因

1.6 神经系统疾病基因治疗的载体系统

1.6.1 神经系统疾病基因治疗载体概述

1.6.2 非病毒载体在神经系统疾病中的应用

1.6.3 病毒载体在神经系统疾病基因治疗中的应用

第二章 人泡沫病毒及其作为基因治疗载体的研究进展

2.1 人泡沫病毒的历史背景

2.1.1 人泡沫病毒的分离

2.1.2 人泡沫病毒的起源推测

2.2 人泡沫病毒的基因组结构

2.3 人泡沫病毒的转录特性

2.3.1 人泡沫病毒长末端重复序列及其转录调控

2.3.2 人泡沫病毒基因表达的调控

2.4 人泡沫病毒独特的复制过程

2.5 人泡沫病毒感染的动物模型

2.6 人泡沫病毒感染与人类疾病的关系

2.7 人泡沫病毒非致病性的可能原因

2.7.1 Bet蛋白的作用

2.7.2 转录调控的作用

2.7.3 免疫应答的作用

2.8 人泡沫病毒作为基因治疗载体的应用前景

2.8.1 人泡沫病毒可复制载体的构建及其应用

2.8.2 人泡沫病毒复制缺陷型载体的构建及其应用

2.8.3 人泡沫病毒杂交载体的构建及其应用

第三章 复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒P△GP的构建及转染小肠癌细胞的研究

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 菌株和载体

3.2.2 细胞系

3.2.3 主要工具酶与试剂

3.2.4 寡核苷酸引物的合成

3.2.5 LB培养基的制备

3.2.6 HIC细胞培养试剂

3.2.7 常用溶液的配制

3.2.8 主要仪器

3.3 实验方法

3.3.1 质粒DNA的小量提取和纯化

3.3.2 质粒提取试剂盒提取质粒

3.3.3 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR)

3.3.4 DNA片段的回收

3.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及电转化法

3.3.6 酶切和连接

3.3.7 细胞的培养、转染及其荧光检测

3.4 结果

3.4.1 复制缺陷型HFV载体辅助质粒p△GP的构建

3.4.2 辅助质粒p△GP的酶切鉴定

3.4.3 复制缺陷型HFV载体和辅助质粒p△GP共转染HIC细胞

3.5 讨论

第四章 HFV载体介导EGFP在培养的大鼠海马神经元中的表达

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 质粒

4.2.2 试剂

4.2.3 细胞及细胞培养

4.2.4 免疫组织化学

4.2.5 转染与缺陷型病毒颗粒的产生

4.2.6 缺陷型病毒载体感染海马神经元

4.3 结果

4.3.1 海马神经元的形态学观察

4.3.2 海马神经元的免疫组织化学鉴定

4.3.3 rdvGFP在大鼠海马神经元中的转导和EGFP表达

4.3.4 流式细胞仪检测EGFP荧光

4.4 讨论

4.4.1 海马神经元的体外培养

4.4.2 HFV载体转导海马神经元

第五章 HFV载体介导谷氨酸脱羧酶基因在培养的大鼠海马神经元中的表达

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 质粒与菌株

5.2.2 细胞及细胞培养

5.2.3 引物

5.2.4 主要工具酶与试剂

5.2.5 质粒DNA的提取、纯化、酶切、重组和克隆

5.2.6 转染与缺陷型病毒颗粒的产生

5.2.7 免疫组织化学

5.2.8 高效液相色谱(HPLC)测定氨基酸

5.3 结果

5.3.1 复制缺陷型人泡沫病毒重组载体质粒pGPSNI-hGAD67和pGPSNI-hGAD65的构建

5.3.2 HFV介导GAD基因对海马神经元GAD表达的影响

5.3.3 HFV介导GAD基因对海马神经元GABA合成和释放的影响

5.4 讨论

5.4.1 GABA与神经系统疾病

5.4.2 关于谷氨酸脱羧酶

5.4.3 关于HFV载体介导GAD基因在海马神经元中的表达

第六章 HFV介导外源基因在培养的星形胶质细胞中的表达

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 质粒

6.2.2 试剂

6.2.3 细胞及细胞培养

6.2.4 转染与缺陷型病毒颗粒的产生

6.2.5 缺陷型病毒载体rdvGFP感染星形胶质细胞

6.2.6 缺陷型病毒载体rdvGAD67和rdvGAD65感染星形胶质细胞及其免疫组织化学反应

6.2.7 HPLC测定氨基酸

6.3 结果

6.3.1 星形胶质细胞的形态学观察

6.3.2 星形胶质细胞的免疫组织化学鉴定

6.3.3 rdvGFP在星形胶质细胞中的转导和EGFP的表达

6.3.4 流式细胞仪检测EGFP荧光

6.3.5 HFV介导GAD基因在星形胶质细胞中的表达

6.3.6 HFV介导GAD基因对星形胶质细胞GABA合成和释放的影响

6.4 讨论

6.4.1 星形胶质细胞体外培养

6.4.2 HFV载体转导星形胶质细胞

参考文献

本研究工作的创新点

博士研究生期间发表论文情况

致谢

发布时间: 2006-03-27

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