用拟南芥表达重组人胰岛素原研究

论文摘要

糖尿病是由于体内胰岛素（insulin）绝对或相对分泌不足而引发的以高血糖为特征的慢性、全身性代谢疾病,因而胰岛素是治疗糖尿病的特效药物。传统的由动物组织提取或微生物发酵的方法生产胰岛素存在一些不足。近年来人们发现利用植物反应器生产胰岛素有一定优势,但也存在副产物过多、纯化困难的问题。本文在对人胰岛素原基因进行改造的基础上,探讨以模式植物拟南芥为材料、利用植物油体表达系统生产重组人胰岛素原,具体工作如下。1.从沪油15油菜（Brassica nape cv. Huyou 15）中克隆油体（oleosin）启动子和油体蛋白基因（BN-V）。按植物偏爱密码子设计合成256 bp人胰岛素基因（mins）,并将其连接于oleosin基因（OG）下游构建融合基因。为便于外源蛋白检测和纯化,在mins基因前端引入6个组氨酸的his-tag,并最终构建成植物种子特异性表达载体pCAMBIA2300-op::og-hmins （ohmins）。2.利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） GV3101介导通过花粉管通道法转化哥伦比亚型拟南芥（Arabidopsis thaliana）,经卡那抗生素（100 mg·L-1）培养基筛选,获得了15株抗性苗,经PCR检测获得12株阳性植株。3.选取其中5株进行Southern blot杂交,结果显示目的基因已经整合到拟南芥基因组中,拷贝数为1-4个。4.实时荧光定量PCR结果表明目的基因（ohmins）在拟南芥中成功转录。5. SDS-PAGE和Western杂交结果证明外源蛋白在拟南芥种子中已经成功表达。6. ELISA结果显示,靶基因ohmins在转基因拟南芥种子中蛋白表达量占总可溶性蛋白（TSP）0.01-0.04%。本研究成功构建了植物油体表达载体,通过农杆菌介导法转化获得转ohmins基因拟南芥,并且ohmins基因在转录和翻译水平均成功表达,为后续利用植物（油菜）油体系统表达胰岛素研究奠定了必要的前期基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 糖尿病对人类健康的影响
• 1.1.1 糖尿病患者群
• 1.1.2 糖尿病病因和分类
• 1.2 胰岛素对糖尿病的治疗
• 1.2.1 胰岛素结构和功能
• 1.2.2 胰岛素药物的发展历程
• 1.2.3 速效和类胰岛素
• 1.2.4 基因工程技术表达重组人胰岛素的研究
• 1.3 植物油体表达系统
• 1.3.1 油体和油体蛋白
• 1.3.2 油体系统的特点和发展现状
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 植物培养基
• 2.1.4 主要生化与化学试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 试剂盒和部分溶液配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 op::og-hmins植物双元表达载体构建
• 2.2.2 oleosin-hmins融合基因植物双元表达载体构建
• 2.2.3 op::og-hmins转化根癌农杆菌GV3101
• 2.2.4 花粉管通道法转化拟南芥
• 2.2.5 转基因拟南芥DNA提取及PCR鉴定
• 2.2.6 转基因拟南芥Southern blot杂交分析
• 2.2.7 荧光定量PCR检测转基因拟南芥ohmins基因的表达
• 2.2.8 靶基因Ohmins翻译水平检测
• 3 结果与分析
• 3.1 op::og-hmins植物双元表达载体构建
• 3.1.1 人胰岛素原基因（mins）的设计
• 3.1.2 双元表达载体op::og-mins构建
• 3.1.3 阳性克隆PCR检测和测序
• 3.2 oleosin-hmins融合基因植物双元表达载体构建
• 3.2.1 PCR突变法获得人胰岛素原基因（hmins）
• 3.2.2 双元表达载体op::og-hmins的构建
• 3.2.3 阳性克隆PCR检测
• 3.3 工程农杆菌GV3101的制备
• 3.4 拟南芥的种植和农杆菌介导的遗传转化
• 3.5 转基因拟南芥的PCR检测
• 3.6 转基因拟南芥Southern杂交分析
• 3.7 荧光定量PCR方法的建立
• 3.7.1 拟南芥各组织RNA的提取
• 3.7.2 荧光定量PCR反应曲线
• 3.7.3 荧光定量PCR工作曲线
• 3.7.4 溶解曲线分析
• 3.7.5 凝胶电泳分析real-time PCR产物
• 3.7.6 荧光定量PCR结果的统计分析
• 3.8 转基因拟南芥外源蛋白表达检测
• 3.8.1 ohmins基因拟南芥总油体蛋白的测定
• 3.8.2 种子总蛋白SDS-PAGE分析
• 3.8.3 种子总蛋白Western Blot杂交分析
• 3.8.4 转基因拟南芥靶蛋白含量的ELISA检测
• 4 讨论与结论
• 4.1 拟南芥作为表达系统的优点
• 4.2 基因和载体的优化
• 4.3 油体系统表达胰岛素原的意义
• 4.4 结论
• 4.5 后续研究工作
• 参考文献
• 附录一 溶液的配制
• 附录二 英文缩略词表
• 附录三 本实验所使用的试剂
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢