论文摘要
在众多环境污染物中,微囊藻毒素（Microcystins,MC）是一种由于人类活动而大量存在的天然污染物,它对人类健康构成日益严重的威胁因而越来越引起人们的关注。MC是蓝藻的微囊藻属、鱼腥藻属、颤藻属及念珠藻属的某些品系产生的次生代谢物,蓝藻水华的普遍发生使MC成为了一种存在广、影响大的天然毒物。由于MC的高急性毒性、强促癌活性以及与人类癌症发生的相关性,使其受到研究人员的广泛重视。目前已经发现MC可以有效地抑制蛋白磷酸酶1（Proteinphosphatase 1,PP1）和2A（Protein phosphatase 2A,PP2A）的活性,从而对很多细胞内过程造成影响,普遍认为这种专一性的抑制作用与MC的强促癌活性有关。PP2A主要以核心酶形式在细胞内大量存在,它的核心酶由A结构亚基（PP2A-A）和C催化亚基（PP2AC）组成。PP2A核心酶可以单独存在,也可以与B调节亚基进一步结合形成异三聚体形式的全酶。A亚基的结构十分罕见,它由15个前后串联的含39个氨基酸序列的HEAT（huntingtin-elonga-tion-Asubunit-TOR,HEAT）基序构成。PP2A是参与很多重要细胞功能的主要蛋白磷酸酶之一,它可以调节很多种细胞内过程,如新陈代谢、转录、RNA剪接、翻译、DNA复制、细胞周期、信号转导、细胞分化以及致癌性转化等。热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）是不同生物体内在氨基酸组成上有着高度同一性的一组蛋白,它们在植物、细菌和动物细胞内都有广泛表达,在多种应激性刺激的作用下HSPs的生成会增加,HSP和应激相关已经是一个在所有动物种类中可以观察到的普遍现象。而HSP70家族是HSP家族中最为保守和研究最为广泛的一种。在无应激的环境下它在很多细胞过程中扮演了多种关键的角色;应激环境下,HSP70能对多种物质或因素如热、酒精、氧化损伤、辐射、重金属、砷、杀虫剂等作出应激性地表达升高反应。虽然对微囊藻毒素毒性及其作用机理的研究已获得了不少成就,但依然还有许多值得深入探讨的问题。本实验室的蛋白质组学研究提示,微囊藻毒素RR可以引起人羊膜细胞FL的多种蛋白表达水平改变,其中包括PP2A-A亚基和HSP70。PP2A和HSP70分别作为微囊藻毒素在细胞内主要作用靶点和一种细胞内广泛存在的伴侣蛋白,微囊藻毒素引起其蛋白水平改变是否具有普遍意义?回答这个问题对于进一步探讨MC的早期影响有着重要的意义。本研究采用微囊藻毒素LR及蓝藻粗提物,研究它们对不同生物材料中PP2A和HSP70蛋白的影响,研究微囊藻毒素引起两种蛋白改变的普遍性,为是否有可能将其作为评价微囊藻毒素早期影响的指标提供实验依据,也为进一步探讨MC的致毒机理提供参考。根据实验设计,采取动物实验和细胞实验相结合的方法。动物实验均采用灌胃染毒:将25只ICR小鼠随机分成5组,每组5只,即空白对照组和4.65、23.25、46.5、93/μg/kg蓝藻藻浆剂量。染毒体积均根据灌胃体积10mL/kg和每只小鼠的体重计算用量,每天一次,共实验7天,第8天将小鼠称重后处死,迅速取出所需脏器。细胞实验方法如下:MC-LR染毒人羊膜细胞FL,染毒浓度为0、0.05、0.1、0.5、1μmol·L-1;人肝细胞HL-7702,染毒浓度为0、0.05、0.2、0.5、1μmol·L-1,作用时间24h。染毒结束后分别提取细胞总蛋白,应用Western-Blot法检测PP2A-A和HSP70蛋白水平。主要结果:1.不同浓度蓝藻藻浆灌胃后,小鼠肝脏PP2A-A蛋白水平在4.65、23.25、46.5和93 ug/kg剂量组明显升高,其中23.25和46.5 ug/kg剂量组与对照组相比差异具有显著性,p＜0.05,93 ug/kg剂量组与对照组相比差异具有显著性,p＜0.01。小鼠肝组织HSP70蛋白水平在93 ug/kg剂量组升高,与对照相比差异具有显著性,p＜0.05。2.不同浓度蓝藻藻浆灌胃后,小鼠肾脏PP2A-A蛋白水平在23.25、46.5和93 ug/kg剂量组明显升高,其中23.25和93 ug/kg剂量组与对照组相比差异具有显著性,p＜0.05。而小鼠肾脏组织HSP70的蛋白水平没有明显的改变。3.不同浓度蓝藻藻浆灌胃后,小鼠脑组织PP2A-A蛋白水平在4.65、23.25、46.5和93 ug/kg剂量组升高,其中4.65和23.25 ug/kg剂量组与对照组相比差异具有显著性,p＜0.05,46.5和93 ug/kg剂量组与对照组相比差异不具有显著性,p＞0.05。小鼠脑组织HSP70蛋白水平在93 ug/kg剂量组升高,与对照相比差异具有显著性,p＜0.01。4.不同浓度MC-LR染毒24h后,人羊膜细胞FL内PP2A-A蛋白水平在0.05、0.1、0.5、1umol/L剂量组升高,且与对照组相比差异具有显著性,p＜0.01。而FL细胞内的HSP70蛋白水平没有明显改变。5.不同浓度MC-LR染毒24h后,HL-7702细胞内PP2A-A蛋白水平有下降趋势,但与对照相比,差异不具有统计学意义;HSP70蛋白水平呈先上升后下降的趋势,在0.5umol/L剂量组HSP70蛋白水平明显高于对照,且差异具有统计学意义,p＜0.05。主要结论:1.体内实验中蓝藻藻浆灌胃染毒能使小鼠肝脏、肾脏和脑组织PP2A-A亚基蛋白水平改变,体外实验中MC-LR染毒能使FL细胞和HL-7702细胞PP2A-A亚基蛋白水平发生改变。PP2A-A亚基蛋白水平的改变有可能是MCs引起的一种敏感而且特异的细胞应答反应。2.蓝藻藻浆灌胃染毒仅使小鼠肝、脑组织、MC暴露仅使HL-7702细胞的HSP70蛋白水平升高,说明蓝藻毒素引起的HSP70不具有普遍性,可能与应激蛋白HSP70的改变具有一定时相性有关。
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