PTEN在肝癌细胞中的作用及其机制的体外研究

论文摘要

第一部分携带PTEN基因的肝癌特异性重组质粒构建及表达论文一肝癌特异性基因治疗载体pAEF-AFP-PTEN的构建目的:构建人甲胎蛋白增强子/启动子调控抑癌基因PTEN的表达载体。方法:通过设计含有特定酶切位点引物,选择性从人肝癌细胞株基因组中PCR扩增截出短的甲胎蛋白（AFP）启动子、增强子,将上述片段与携带野生型抑癌基因PTEN载体多克隆位点连接,构建成为AFP基因顺式作用元件调控的具肝癌特异性表达载体pAEF-AFP-PTEN。结果:将AFP基因启动子、增强子克隆致携带有目的基因载体的多克隆位点,酶切鉴定和DNA序列分析证实为含有人AFP顺式作用元件的质粒。结论:成功构建出AFP顺式作用元件修饰携带抑癌基因PTEN基因治疗载体。论文二重组质粒pAEF-AFP-PTEN在肝癌细胞特异性表达研究目的:观察重组载体pAEF-AFP-PTEN在AFP阳性的肝细胞癌中靶向表达情况。方法:将上述实验中构建的AFP启动子调控的PTEN基因重组载体pAEF-AFP-PTEN以脂质体介导方法分别转染AFP阳性肝癌细胞株HepG2和AFP阴性肝癌细胞株SMCC-7721及正常肝脏细胞株L02、人宫颈癌细胞株Hela,免疫荧光细胞化学、RT-PCR、免疫组织化学和western blot检测重组载体pAEF-AFP-PTEN靶向性表达。结果:重组质粒pAEF-AFP-PTEN在AFP阳性HepG2细胞中可显著表达目的基因PTEN,而在AFP阴性SMCC-7721、L02、Hela则无目的基因表达。结论:重组质粒pAEF-AFP-PTEN具有一定肝癌靶向性。第二部分抑癌基因PTEN对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响目的:探讨外源性抑癌基因PTEN表达对人肝癌细胞系HepG2增殖、体外黏附和侵袭转移能力的影响。方法:利用前述实验中构建的携带人PTEN基因可控性质粒,脂质体介导法转染人肝癌细胞系HepG2,分别采用透射电镜、流式细胞仪分析术、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、细胞黏附试验、Transewll小室法测定体外转染HepG2细胞前、后所致细胞凋亡、细胞增殖活力、细胞体外黏附、侵袭力变化;并进一步利用MTT法评估HepG2质粒转染后对化疗药物阿霉素敏感性改变。均以空白质粒pBp为对照。结果:重组质粒pAEF-AFP-PTEN转染HepG2细胞后,细胞生长活力明显降低,电镜观察可见典型凋亡形态学改变,细胞凋亡率也明显增加,与对照组相比差异有显著统计学意义（P<0.05）;同时转染后细胞在Fn基质上黏附数量减少,体外侵袭力也受到明显抑制。另外,野生型PTEN基因转染能提高人肝癌细胞株HepG2对阿霉素敏感性,使其IC50显著降低（P<0.01）。结论:重组质粒介导的抑癌基因PTEN对肝癌细胞系HepG2增殖、黏附和和体外侵袭能力有明显抑制作用,并可在一定程度上逆转肝癌细胞对阿霉素耐药性,携带PTEN重组质粒可望成为肝癌基因治疗有效工具之一。第三部分PTEN抑制肝癌细胞生长作用机制的初步探讨目的:初步探讨抑癌基因PTEN对肝癌细胞生长抑制作用的相关机制。方法:利用免疫组化、RT-PCR方法检测肝癌及其相应癌旁组织中PTEN与pAkt、核转录因子kappaB（NF-κB）蛋白、mRNA表达情况并分析三者间相关性;单独或联合采用PI3K特异性抑制剂LY294002及NF-κB特异性抑制剂PDTC,体外作用于转染及未转染重组质粒、空白质粒肝癌细胞株HepG2,应用RT-PCR、Westernblot对PTEN、pAkt、NF-κB mRNA、蛋白水平进行检测;EMSA、共聚焦显微镜观察NF-κB转录活性、细胞核内表达情况。结果:肝癌组织中抑癌基因PTEN mRNA、蛋白表达较癌旁组织均显著下降;与此相反,pAkt、NF-κB蛋白、mRNA在肝癌组织中表达水平较癌旁组织明显升高,并具有统计学意义（P<0.05）。相关分析显示,肝癌组织中PTEN与pAkt、NF-κB均呈负相关,而pAkt与NF-κB则呈现正相关。未转染重组质粒或转染空白质粒肝癌细胞株HepG2中,单独使用LY294002可使细胞内pAkt、NF-κB mRNA、蛋白表达较未作用前明显下降;而单独使用PDTC作用于HepG2细胞后,仅观察到NF-κB表达下降及其活性降低,而并未发现pAkt mRNA、蛋白水平的明显改变。进一步在转染抑癌基因PTEN HepG2细胞中,采用同样方法进行干预,未出现pAkt、NF-κB上述类似变化。结论:抑癌基因PTEN对肝癌细胞生长抑制作用可能是通过对pAkt-NF-κB信号传导通路调控实现的,从而为PTEN用于肝癌基因治疗奠定相关理论基础。

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 第一部分 携带PTEN基因的肝癌特异性重组质粒构建及表达
• 论文一 肝癌特异性基因治疗载体pAEF—AFP-PTEN的构建
• 论文二 重组质粒pAEF-AFP-PTEN在肝癌细胞特异性表达研究
• 第二部分 抑癌基因PTEN对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响
• 第三部分 PTEN抑制肝癌细胞生长作用机制的初步探讨
• 综述一 端粒酶逆转录酶的转录调控机制与肿瘤
• 综述二 肝癌基因治疗的近况及前景
• 附录1 主要试剂配制
• 附录2 主要实验步骤
• 附录3 攻读学位期间发表论文
• 致谢