论文摘要
肌钙蛋白复合物由肌钙蛋白C、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T三个不同的亚基组成，在Ca2+作用下，主要参与肌肉的收缩调节。肌钙蛋白I作为一个亚单位主要抑制肌凝蛋白ATP酶的活性。心肌肌钙蛋白I不在任何骨骼肌组织中表达，具有心肌组织特异性，这使得其成为检测心肌损伤最好的生化标志物之一。研究表明AMI患者胸痛发生的早期心肌肌钙蛋白I就被释放入血流，14—36小时其浓度达到最高峰。心肌损伤后的3—7天仍能检测到心肌肌钙蛋白I水平的升高。因此，心肌损伤的检测可通过检测血清中心肌肌钙蛋白I的水平来进行，并且具有灵敏度高、特异性强和诊断窗口期长的特点。进一步研究表明急性冠脉综合症死亡风险与心肌肌钙蛋白I的水平具有相关性。在一些非致死的心肌损伤、充血性心衰等心脏疾病中也检测到心肌肌钙蛋白I水平的升高。目前，心肌肌钙蛋白I已成为临床上诊断心肌损伤的“金标准”。本研究的目的是构建稳定、高效表达重组人心肌肌钙蛋白I的基因工程菌株，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料，促进心肌肌钙蛋白I诊断标准化的研究。为使目的蛋白高效表达，在设计引物时在上游引物的5′端的第2位（GCG突变为GCC）和第4位（GGG突变为GGT）密码子的第3个简并碱基引入定点突变，该简并碱基的突变不影响密码子编码的氨基酸的类型。上下游引物的两端分别插入NdeI内切酶位点和BamHI内切酶位点，可使目的基因准确的插入pET21a（+）表达载体，并简化cDNA克隆阶段的操作。采用RT—PCR方法从人心肌组织总RNA中克隆出全长的人心肌肌钙蛋白I基因，将其插入到pMD19—T克隆载体中，经酶切和测序对目的基因分析，再插入到pET-21a（+）表达载体中，转化BL21（DE3），对诱导表达的目的蛋白行SDS-PAGE和采用锐普（R）心梗仪检测重组蛋白的抗原性并准确定量。连续传代试验验证基因工程菌稳定性。克隆了全长的cTnI基因，目的蛋白表达量达菌体总蛋白的38％，重组蛋白抗原性良好，基因工程菌具有较高的稳定性。综上所述，成功构建稳定、高效表达重组人心肌肌钙蛋白I的基因工程菌。