重组酶β蛋白、β蛋白177、FLP基因的合成、表达及活性检测

论文摘要

体内重组工程是一种近年来兴起的新型遗传工程技术。它基于重组酶和体内同源重组反应,可以摆脱传统重组技术的限制性内切酶的束缚,减少了繁杂的酶切、连接步骤,达到了简化实验操作、缩短实验周期的目的；通过重组酶的介导,大大提高了重组的高效性、精确性和适应性,被认为是自PCR技术诞生以来基因工程中最为重要的进展和突破,并具有取代传统DNA重组技术的趋势。重组酶p蛋白可以作为单链退火蛋白,促进DNA互补链的退火,提高同源重组效率；重组酶FLP可以识别FRT位点,完成位点间DNA序列的交换、重组、删除与逆转；并且已成功应用于多种微生物菌种的遗传改造。本研究着眼于转变传统育种模式,克隆和表达了β蛋白和FLP的编码基因,并进行了纯化酶的重组活性研究,为重组酶的商业开发和拓展其应用奠定了基础。主要研究成果如下：（1）按照大肠杆菌碱基偏好性设计βpro基因序列,采用重叠延伸PCR技术,人工合成了编码β蛋白的βpro基因,测序结果与设计100%一致。构建了表达载体pET30a-βpro,转化E.ooli BL21（DE3）,优化诱导条件,SDS电泳结果显示一条明显的28 kD的特异性融合蛋白,与理论分子量一致。（2）为了提高p蛋白的稳定性及可溶性表达量,去除冗余结构,构建了含有1-177个氨基酸残基的p蛋白177表达载体pET30a-βpro177;转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS电泳结果显示获得β蛋白177的可溶性表达；利用DNA的增色效应,检测了纯化β蛋白177的体外活性,实验结果表明：诱导表达的177个氨基酸残基的β蛋白177具有介导单链DNA退火的活性。（3）构建了表达载体pQE32-flp,转化E. coli Ml 5,经诱导表达,SDS电泳结果显示45 kD的明显条带,与FLP理论分子量相符;构建了带有FRT位点的卡那霉素表达盒质粒pMD18-FRT-kan-FRT,将纯化的FLP与底物载体pMD18-FRT-kan-FRT反应,琼脂糖凝胶电泳结果显示FLP重组酶具有删除两个同向FRT位点间DNA序列的活性。（4）构建了带有不同启动子的flp基因的宽宿主表达载体pBB1MCS psldh-fpl、 pBB1MCS-ptufb-flp和pBBlMCS-pgen-flp,转化弱氧化醋酸杆菌,获得阳性转化子；采用两步法RT-PCR验证,结果表明FLP酶在宿主细胞中已转录表达,为FLP酶应用于弱氧化醋酸杆菌的遗传改造奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 本课题研究的背景及意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 Red重组系统的研究进展
• 1.2.2 FLP/FRT重组系统的研究进展
• 1.2.3 重组工程的应用
• 1.3 本课题的研究内容
• 第2章 重组酶βpro基因的合成与原核表达
• 2.1 材料和仪器
• 2.1.1 实验所需药品
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 菌株及载体
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 各种试剂盒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 βpro基因的合成
• 2.2.2 纯化回收DNA
• 2.2.4 原核表达载体pET30a-βpro的构建
• 2.2.5 重组酶βpro基因的原核表达
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 βpro基因的合成
• 2.3.2 克隆载体pEASY-βpro的构建及其鉴定
• 2.3.3 表达载体pET30a-βpro的构建与鉴定
• 2.3.4 βpro基因在E.coli BL21中的诱导表达以及SDS-PAGE分析
• 2.4 本章小节
• 第3章 重组酶βpro177基因的表达载体构建、表达及活性检测
• 3.1 材料和仪器
• 3.1.1 实验所需药品
• 3.1.2 菌株及载体
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 仪器设备与实验耗材
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 βpro177基因的扩增
• 3.2.2 表达载体pET30a-βpro177的构建
• 3.2.3 重组酶βpro177基因的诱导表达及蛋白纯化
• 3.2.4 蛋白含量的测定
• 3.2.5 β蛋白177活性检测方法的建立
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 表达载体pET30a-βpro177的构建与鉴定
• 3.3.2 pET30a-βpro177蛋白表达及纯化后SDS-PAGE分析
• 3.3.3 β蛋白177含量的测定
• 3.3.4 β蛋白177体外活性检测
• 3.4 本章小节
• 第4章 重组酶flp基因的克隆、原核表达及活性检测
• 4.1 材料和仪器
• 4.1.1 实验所需药品
• 4.1.2 菌株及载体
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 试剂
• 4.1.5 仪器设备与实验耗材
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 引物设计与合成
• 4.2.2 目的片段的扩增
• 4.2.3 表达载体pQE32-flp的构建
• 4.2.4 大肠杆菌M15的转化
• 4.2.5 flp基因在大肠杆菌M15中的诱导表达
• 4.2.6 重组酶FLP体外活性检测
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 重组载体pQE32-flp的构建
• 4.3.2 flp基因在大肠杆菌M15中的诱导表达
• 4.3.3 重组酶FLP活性检测
• 4.4 本章小结
• 第5章 FLP重组酶在代谢工程中的应用
• 5.1 材料和仪器
• 5.1.1 实验所需药品
• 5.1.2 菌株及载体
• 5.1.3 培养基
• 5.1.4 仪器设备与实验耗材
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 引物设计与合成
• 5.2.2 目的片段的PCR扩增
• 5.2.3 flp基因重组表达质粒的构建
• 5.2.4 弱氧化醋酸杆菌的转化及转化子验证
• 5.2.5 Trizol法提取弱氧化醋酸杆菌中的总RNA
• 5.2.6 RT-PCR验证目的基因的表达水平
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 重叠延伸PCR融合启动子与flp基因
• 5.3.2 含有启动子基因psldh、ptufb、pgen的flp基因重组质粒构建
• 5.3.3 flp基因在弱氧化醋酸杆菌中的转录
• 5.4 本章小节
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢