miRNA在EV71感染与复制中的作用初步研究

论文摘要

手足口病是婴幼儿的常见疾病,病原体以新型肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）最为常见。近来世界各地大范围手足口病的爆发性疫情主要由EV71引起。EV71属小RNA病毒科、人肠道病毒属成员。虽然EV71感染患者大多数症状轻微,但也有部分患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经性肺水肿和心肌炎等重症症状。重症患儿病情进展快,易导致死亡。鉴于目前并没有针对EV71感染的抗病毒药物,只能对一般患者及重症疑似病例进行跟踪,出现症状对症治疗。因此加强对EV71感染的基础性研究,包括EV71复制的分子生物学特性、影响病毒复制的重要因素等显得十分必要。尽管国内外有关EV71的研究工作取得很大进展,但深入了解EV71病毒复制的关键环节仍然十分迫切。最近研究发现,细胞编码的microRNA（miRNA）分子与许多病毒复制关系密切。miRNA影响病毒的复制,一方面可通过影响与病毒复制密切相关的关键细胞分子,如免疫应答分子、信号转导蛋白等而调控病毒的复制进程,另外还可能通过直接作用病毒mRNA,调节病毒的复制。由于miRNA分子在转录后水平对基因调控具有普遍意义,并且细胞编码的miRNA种类众多,同一：niRNA可能有多个潜在靶点,同时单一基因可能受多个miRNA分子作用,形成复杂的调控网络。因此推测,EV71感染致病过程极有可能与miRNA分子发挥作用相关。所以,我们从miRNA对EV71感染后的变化为出发点,结合生物信息学分析,对可能影响EV71感染和复制的miRNA分子及其作用靶点进行分析,试图寻找影响EV71致病的关键因素。在本研究中,我们从手足口病患儿粪便中分离了一株EV71病毒并进行了全基因组测序分析。由于EV71病毒形成噬斑形状不规则,难于鉴定。为了准确检测实验中所用病毒的滴度,我们建立了优于常用的蚀斑分析（Plaque assay）的MTT病毒滴度检测法。然后,根据EV71病毒复制生长曲线,我们使用miRNA芯片检测了EV71感染细胞后细胞内miRNA的表达水平变化,发现了38个miRNA分子表达水平比在未感染细胞中表达水平上调2倍以上,35个miRNA分子表达水平比在未感染细胞中表达水平下调2倍以上。通过生物信息学分析这些miRNA作用的靶基因,发现这些miRNA的靶点主要为细胞结构蛋白相关基因和免疫调节相关基因,初步探讨了与EV71感染后细胞中异常表达的基因的关系。此外,我们利用miRNA数据库和软件分析可能直接作用于EV71-3’-UTR的miRNA分子,通过种子序列匹配和结合自由能阈值设定,共找到了12个可能直接结合到EV71-3’-UTR区域从而影响EV71感染与复制的miRNA。通过miRNA芯片筛选和软件预测后,将这些可能影响EV71感染和复制的miRNA基因克隆入带有报告基因的载体。我们共选取30个芯片筛选得到的miRNA和10个软件预测得到的miRNA,构建了可能影响EV71感染和复制的微型miRNA表达库。之后,为了验证miiRNA抑制EV71感染与复制的能力,我们选择了报告基因表达水平较高的miRNA-3620表达载体进行初步测试。将EV71-3’-UTR的报告基因GFP载体与miRNA-3620表达载体共转染细胞检测miRNA-3620分子是否影响EV71的感染与复制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 miRNA芯片检测与EV71感染相关的miRNA
• 引言
• 第一节 EV71病毒株的分离与全基因组测序
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 miRNA芯片检测与EV71感染相关的miRNA分子
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二章 生物信息学分析直接作用于EV71-3'-UTR的miRNA
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三章 影响EV71复制的miRNA表达库的建立
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四章 影响EV71复制miRNA的初步筛选
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 主要研究成果
• 致谢