四种发育调控因子mRNA在早期鸡胚中的分布及其在胚胎发育中的作用研究

论文摘要

采用体外转录的方法,分别在SP6和T7 RNA聚合酶的作用下合成地高辛（DIG）标记的Cdc25A, Cdc25B, Sox2和Mnb/Dyrk RNA探针。通过全胚胎原位杂交的方法检测早期鸡胚中上述四种基因mRNA的表达模式。结果表明,四种基因mRNA的表达模式是部分重叠或互补的,大部分表达于整个中枢神经系统（CNS）,但也有表达于体节和肢芽。在特异的区域,四种基因的mRNA丰度是存在差异的。在鸡胚早期不同发育阶段,四种基因的表达模式支持了它们可能在早期的鸡胚发育中具有重要的调节功能,而且它们之间具有一定的相互调控作用。试验ⅠCdc25ARNA探针的制备本试验应用RT-PCR方法从鸡胚中扩增Cdc25A的基因片段,通过T-A克隆将其连接于pGM-T质粒载体中构成Cdc25A/pGM-T重组质粒。并将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α株感受态细胞中扩增,经挑取阳性克隆进行扩增培养、小量提取质粒,再根据pGM-T的多克隆酶切位点,进行酶切鉴定,然后经测序验证。测序正确后,将阳性株扩增后提取的质粒分别用限制性内切酶NcoⅠ和SpeⅠ进行酶切,使其完全线性化。回收酶切片段,作为合成正、反义RNA探针的模板。分别利用pGM-T中T7和SP6的RNA聚合酶的启动子,在RNA聚合酶的作用下,以线性化的Cdc25A/pGM-T为模板,按Roche地高辛标记试剂盒说明书,利用试剂盒中含有的DIG-dUTP底物混合物,分别用Sp6和T7转录酶进行体外转录,成功转录得到长度为183nt的正、反义DIG标记的RNA探针,为后续的原位杂交试验做好了探针的准备。试验ⅡCdc25A mRNA在早期鸡胚中的分布本试验通过全胚胎原位杂交的方法,使用Cdc25A RNA探针检测其mRNA在早期鸡胚中的分布。结果表明,在9HH（Hamburger and Hamilton）阶段,脑部的杂交信号相对于后期阶段（10,11HH）不强,但中部神经管杂交信号相对于后期阶段较强。后部神经沟,尾部神经板杂交信号此时较强。体节部位信号最弱。在10HH阶段,脑部杂交信号此时很强,但中部神经管杂交信号很弱。体节处的杂交信号也较少。后部神经沟,尾部神经板杂交信号依然较强。在11HH阶段,头部区域的杂交信号仍然最强,中部神经管杂交信号有所加强,后部神经沟,尾部神经板杂交信号有所减弱。此时,在心原基中未见杂交信号。这些结果说明,Cdc25A mRNA的表达模式与增殖中的神经上皮分布区域基本一致。试验ⅢCdc25B RNA探针的制备及其mRNA在早期鸡胚神经管、体节和肢芽中的分布本试验使用分子克隆的方法获得特异性Cdc25B基因目的片段,以线性化的Cdc25B/pGM-T重组质粒为模板,应用体外转录的方法合成长度为575nt的正、反义地高辛标记的Cdc25B RNA探针。通过全胚胎原位杂交方法,用体外转录的Cdc25BRNA探针探查Cdc25B mRNA在早期鸡胚中的动态表达模式。结果表明,在5HH阶段,Cdc25B原位杂交信号在整个胚胎中分布是微弱的,特别是在头部区域,但在亨氏节（Hensen’s node）中杂交信号可见。此时,Cdc25B杂交信号不对称地分布在亨氏节的左侧。在6HH阶段,脑部杂交信号已经清晰可见。杂交信号在亨氏节和原条两侧是不对称的。到了8ˉHH期,脑部杂交信号很强,并且在神经褶中Cdc25B原位杂交信号也较强。此时,神经褶两侧杂交信号分布是对称的,但亨氏节两侧信号仍然是不对称的。在全胚胎原位杂交的横断切片中,Cdc25B原位杂交信号分布在底板。在即将封闭的神经管中,杂交信号呈现出腹背递减的浓度梯度,而且,在大部分尾部神经上皮中缺乏杂交信号。体节中的杂交信号很弱。直到8HH阶段,Cdc25B原位杂交信号在脑部很强。在体节中的杂交信号也较强。从Cdc25B原位杂交的横断切片来看,在8HH阶段,杂交信号在神经管和神经沟两侧是对称的,但在即将封闭的神经管和神经沟中,杂交信号仍然呈现出腹背递减的浓度梯度。从9ˉ到10HH阶段,杂交信号分布于CNS,包括脑部,神经管和神经沟。特别是,脑部的杂交信号很强,但是在10HH阶段,在尾部神经板中没有杂交信号。此外,体节中的信号较强。在12HH阶段,Cdc25B原位杂交信号分布于CNS,特别是脑部比先前发育阶段信号更强。此时,体节中的杂交信号较强。在三天的鸡胚（18HH阶段）切片中,Cdc25B原位杂交信号仍然分布在神经管的腹部区域。体节中信号很强。同时在肢芽的顶端,即AER区域,Cdc25B原位杂交信号很强。在后期的23HH阶段,杂交信号广泛分布于发育中的脊髓,主要分布在腹部区域,并且在腹部区域的外侧缘检测到强烈的信号。此时,体节中信号也较强。然而,自始至终,在早期鸡胚不同发育阶段,脊索都是阴性的。所有这些结果说明,在早期鸡胚不同发育阶段,Cdc25B mRNA主要分布于CNS,在体节和肢芽中也有不同程度地分布。但是,大部分尾部神经上皮中缺乏Cdc25B mRNA分布。试验ⅣSox2 RNA探针的制备及其mRNA在早期鸡胚中的原位杂交检测本试验应用体外转录的方法合成正、反义地高辛标记的Sox2 RNA探针。通过全胚胎原位杂交方法,使用体外转录的探针检测Sox2 mRNA在10HH阶段鸡胚中的表达情况。结果表明,Sox2原位杂交信号沿着CNS区域分布。杂交信号在脑部很强。中部神经管的杂交信号较弱。然而,在尾部神经板杂交信号较强。此外,在体节中并未见到杂交信号。这些结果说明,Sox2 mRNA主要分布在CNS未成熟的神经上皮中。Sox2 mRNA与Cdc25A mRNA在早期鸡胚中的分布模式具有相似性。试验ⅤMnb/Dyrk RNA探针的制备及其全鸡胚原位杂交反应本试验应用体外转录的方法合成正、反义地高辛标记Mnb/Dyrk的RNA探针。通过全胚胎原位杂交方法,用体外转录的RNA探针检测了10HH阶段的鸡胚Mnb/Dyrk mRNA的表达模式。结果表明,Mnb/Dyrk原位杂交信号在CNS中很强。在封闭的神经管中可检测到杂交信号,包括将来发育为前脑,中脑和菱脑的区域,以及脊髓。在头部有很强的杂交信号。尾部神经板区域杂交信号很弱。此外,在体节中杂交信号很弱。这些结果说明,Mnb/Dyrk mRNA主要分布于CNS中。Mnb/Dyrk mRNA在早期鸡胚中的分布与Cdc25B是相似的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 脊椎动物中枢神经系统,体节和肢芽的早期发育研究进展
• 第一节 中枢神经系统发育过程
• 第二节 脊椎动物体节和肢芽的发育
• 第三节 脊椎动物中枢神经系统发育相关基因的调控
• 参考文献
• 第二章 Cdc25的研究进展
• 第一节 Cdc25与细胞周期调控
• 第二节 Cdc25与DNA损伤及检测点应答
• 参考文献
• 第三章 Sox2的研究进展
• 第一节 Sox2基因和蛋白的生物学特性
• 第二节 Sox基因家族的功能研究现状及研究前景
• 参考文献
• 第四章 Mnb/Dyrk的研究进展
• 第一节 Mnb/Dyrk蛋白的生物学特性和作用机制
• 第二节 Mnb/Dyrk蛋白的生理作用
• 参考文献
• 第二篇 试验部分
• 第五章 Cdc25A RNA探针的制备
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第六章 Cdc25A mRNA在早期鸡胚中的分布
• 1. 材料与方法
• 2. 实验过程
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 参考文献
• 第七章 Cdc25B RNA探针的制备及其mRNA在早期鸡胚神经管、体节和肢芽中的分布
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第八章 Sox2 RNA探针的制备及其mRNA在早期鸡胚中的原位杂交检测
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第九章 Mnb/Dyrk RNA探针的制备及其全鸡胚原位杂交反应
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 附录Ⅰ 测序结果
• 附录Ⅱ 原位杂交中相关试剂的配制
• 论文发表情况
• 致谢