论文摘要
作为传统的名贵中药材,林蛙油价格昂贵,假货泛滥。同时作为干燥的动物组织的林蛙油,无法利用中药鉴定金标准——基源鉴定进行样本的鉴定。随着现代科学技术的快速发展,传统中药材的鉴定方法也在发生悄然变化,在传统鉴定技术的基础上开始引入新技术和新方法。本文尝试将分子生物学技术引入到传统名贵中药材哈士蟆油的鉴定工作中,解决作为动物组织的中药材无法应用基于动物整体形态特征的的基源鉴定技术的问题。从林蛙原产地直接捕捉活蛙,聘请相关专家进行基源鉴定后,作为林蛙油鉴定技术开发的样本使用,以解决所使用样本的道地性问题。项目组共收集了包括4个中国林蛙亚种、7个林蛙种以及中华大蟾蜍、黑斑蛙、牛蛙在内的13个样本。利用动物基因组的全能性,从体细胞及蛙油中提取基因组,作为扩增的模板。从150条随机引物中筛选出扩增多态性较好的30个引物,对19个样本进行RAPD扩增,从中挑出8个结果进行多态性分析。8条筛选得到的随机引物对19个样本进行扩增,共得到786条多态性扩增片段；其中含有差异性条带120条。1、2、3号样本均为长白山亚种的基因组,而引物S13l能扩增出长度为2100bp的特异性条带,该条带可以作为长白山亚种与其他样本的潜在基因靶点进行开发,同时引物S131能作为长白山亚种与其他样本的鉴别引物使用。引物S339能对16号样本在2000bp处扩增出特异性条带,因此可作为牛蛙与其他样本间的鉴别引物。将所有的差异性条带汇总成一个速查表。如需鉴定某个样本的产地,则只需提取基因组后,用8个RAPD引物进行扩增,看相应条带是否出现就可进行产地判断。设计18S rRNA的扩增引物F18S-hindIII和EcoRI,以制备的基因组为模板,扩增18S rRNA相对应DNA序列,并将其转入pUC测序载体中进行部分序列测定。中国林蛙长白山亚种体细胞和蛙油、中华大蟾蜍体细胞和蛙油、黑斑蛙体细胞和蛙油扩增制备的18S rRNA序列完全匹配,体细胞可以代替蛙油作为样本使用。基于分子生物学的林蛙油鉴定技术开发,所选样本不要求必须是蛙油。目前市场上销售的朝鲜大油就是中国林蛙长白山亚种的输卵管制备的林蛙油,朝鲜小油就是黑龙江林蛙的输卵管制备的林蛙油。不同种之间的18S rRNA序列上有差异,以长白山亚种的18S rRNA序列为参照,将差异信息进行统计汇总,可以作为测序后种属鉴定的依据,根据序列上的核苷酸突变情况可确定蛙油的确切种属。与RAPD相比,测序重复性更好,但是操作较繁琐,样品需要送到外地测序,耗时较长,同时应警惕测序的方法误差所带来的影响。利用Clustalx2.0程序对14个样本的18S rRNA序列进行对位排列,使用phylip3.6程序包构建的系统发生树。利用Bootstrap法对进化树进行评估后,采用最大简约性法、最大可能性法、邻位相连法分别构建的进化树。结果表明,利用现有技术可以较方便的获取特定基因序列信息,从而进行种属鉴定、系统发育研究。但是作为特定的算法,利用序列上的差异信息进行计算,在某些方面可以很好的模拟其系统发育过程。不过,由于在系统进行的过程中基因组上的核酸的突变是偶然的,随机的,针对同一组数据,不同的算法所得到的结果相差很多,这也提示利用分子信息模拟系统发育钟得技术还不是很成熟,需要通过大量的数据和实验进行更深一步的研究。