论文摘要
蛇毒类凝血酶属于纤维蛋白原裂解酶，是一种丝氨酸蛋白酶。它们降解纤维蛋白原但不激活凝血因子FactorⅩⅢ，形成的纤维蛋白块能被后继的血液纤溶系统清除。由于它们在血浆中能够降低纤维蛋白原，可以作为抗凝剂使用。从珍稀树栖毒蛇——大连蛇岛蝮蛇（Gloydius shedaoensis）毒液中分离制备的蛇毒类凝血酶制品已经在血栓病临床治疗应用了很多年。可是鉴于国家法律法规禁止捕蛇，天然酶生产面临严峻的挑战，因而基因工程方法是解决这一困境的最佳选择之一。本论文内容主要就获得可溶性、活性重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的制备，尤其是其纤维蛋白原裂解活性开展研究工作。（一）在大肠杆菌体系中可溶、活性大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的克隆与表达使用Wilkinson-Harrison蛋白质可溶性概率模型，对带有不同商业化融合标签的重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的可溶性趋势进行预测，结果显示在N端融合有NusA、GST和TrxA的重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶具有更高的可溶性。因而选择NusA、GST和TrxA三种标签用于促进大连蛇岛蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的可溶性表达。相应地，构建了pQYNusA-glo-a、pQYGST-Glo-a和pQYTrxA-Glo-a三种表达质粒，转化获得了相应的大肠杆菌BL21-Gold（DE3）重组菌株。SDS-PAGE分析和Western blotting检测确定pQYNusA-Glo-a的可溶性表达状况最佳。（二）重组蛇毒类凝血酶的分离纯化1、首次使用人工核酸酶R5对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶样品预处理：在400 nm紫外光激发条件下，1 mM R5可以高效去除重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶样品中的核酸杂质，而对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的活力没有造成损伤。由于合成成本低，人工核酸酶R5在蛋白质／酶的生产中具有很好的应用前景。2、采用四步柱层析方法获得高纯度重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶：柱层析依次包括Phenyl Sepharose FF疏水层析、Q Sepharose HP阴离子交换层析、Mono Q高分辨阴离子交换层析和Superdex 200分子排阻层析，最终获得重组蛇岛蝮蛇类凝血酶在SDS-PAGE胶上呈现单一条带，产率为0．1 mg／L。其表观分子量90 kDa，比活力为506 U／mg。（三）重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的生化性质表征：1、重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶酶学性质：具有纤维蛋白原凝结活性、纤维蛋白原裂解活性以及酰胺水解活性。以酰胺水解活性底物BApNA为模式底物，该酶催化活性最适温度为40℃，最适pH为8．0。重组酶对纤维蛋白原裂解呈现剂量依赖和时间依赖，其裂解方式为：优先裂解Aα-链，然后裂解Bβ-链，但不裂解γ-链。2、抑制剂对酰胺水解酶活力的影响：研究了多种丝氨酸蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂及凝血酶抑制剂对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的影响。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF（1 mM）和TPCK（1 mM）分别抑制了重组酶100％和77％的酰胺水解活力，表明它属于丝氨酸蛋白酶家族。抑制剂苯脒、3-氨基苯脒、4-氨基苯脒和咪唑只抑制了<15％酶活力。EDTA不影响酰胺水解活力，表明大连蛇岛蝮蛇类凝血酶不是金属依赖型蛋白水解酶。还原剂二硫苏糖醇和β-巯基乙醇对酶活力没有影响，表明重组酶具有高度稳定性。凝血酶天然抑制剂如肝素等，不影响重组酶的酰胺水解活力，表明重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶与凝血酶在结构上存在差异。3、抑制剂对纤维蛋白原裂解酶活力的影响：通过SDS-PAGE的方法，研究了丝氨酸蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂及凝血酶抑制剂对重组酶纤维蛋白原裂解活性的影响。丝氨酸蛋白酶抑制剂中只有PMSF具有抑制作用，表明Ser182既是酰胺水解活性又是纤维蛋白原裂解活性的关键氨基酸催化残基。同源模建预测表明PMSF与Ser182之间形成共价键阻碍了底物分子的趋近。可是TPCK只影响了酰胺水解活力，却对纤维蛋白原裂解活力没有影响。EDTA阻碍了重组酶的纤维蛋白原裂解活力，提示金属离子尤其是过渡金属离子在纤维蛋白原裂解过程发挥了作用。EDTA的抑制作用可能与EDTA螯合去除痕量金属离子从而引起底物纤维蛋白原的构象改变有关。还原剂二硫苏糖醇和β-巯基乙醇不抑制酰胺水解活力，表明重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的高稳定性。肝素和水蛭素不影响纤维蛋白原裂解活力，提示重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶可与肝素或水蛭素联合应用于肝素相关血小板减少症和心肺血栓疾病的临床治疗。4、金属离子对酰胺水解活性和纤维蛋白原裂解活性的影响：1)1 mM过渡金属离子对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶酰胺水解活力产生抑制的强弱顺序为：Fe2+>Cu2+≈Zn2+>Hg2+>>Ni2+，EDTA的引入可以恢复>80％被过渡金属离子抑制的重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶酰胺水解活力：其他金属离子Co2+和Mn2+分别抑制了重组酶酰胺水解活力的38％和25％；2)过渡金属离子抑制重组酶的纤维蛋白原裂解活力的强弱顺序为：Cu2+≈Ni2+>Zn2+>Co2+；其他二价金属离子如Ca2+和Mg2+对两种活力都没有影响。根据Irving-Williams晶体场理论，结合同源模建获得的大连蛇岛蝮蛇类凝血酶模型，抑制效应的产生可能和Zn2+与酶催化中心Ser182侧链上O原子、His43咪唑环上N原子以及两分子H2O中O原子之间形成四对配位键有关。综上，本研究通过在目标蛋白N端融合NusA标签的表达策略，获得了重组蛇岛蝮蛇类凝血酶可溶性、活性表达；人工核酸酶R5可以高效地去除重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶粗样品中的核酸杂质，并对重组酶活力没有损伤，表明人工核酸酶R5在生化工程领域中具有很好的应用潜力；利用四步柱层析纯化获得了高纯度的可溶性重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶，表现出高的酰胺水解活性和纤维蛋白原裂解活性；系统研究了丝氨酸蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂、凝血酶抑制剂及二价金属离子对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶活力的影响，结合同源模建手段揭示抑制效应的作用机制。本研究可以为蛇毒类凝血酶的重组制备和临床应用提供依据。