山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究

论文题目: 山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 庞全海

导师: 窦忠英

关键词: 关中奶山羊,骨髓间充质干细胞,分离培养,体外分化

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来自于骨髓的两种干细胞之一,在人、小鼠、大鼠、兔、猪等许多物种的研究证明了该类干细胞具有体外分化为多种细胞表型的能力,有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今未见关于山羊,特别是成年山羊骨髓间充质干细胞分离、培养、分化等方面的系统研究报道。本研究目的在于阐明山羊骨髓间充质干细胞的生物学性能及其分化潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞/基因治疗的模型,以及利用该类细胞作为细胞生物反应器体外生产生物活性物质,进而建立山羊骨髓间充质干细胞细胞系。为此,本试验利用成年关中奶山羊为对象,较为系统全面地研究了其骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增、形态学、生长特性、细胞表面标志,以及体外诱导分化能力。结果如下: 1. 本试验应用贴壁分离法或密度梯度离心法成功分离获得关中奶山羊髂骨骨髓间充质干细胞,体外培养到第21 代,仍然保持其干细胞的特性,并已扩增到2.8×108细胞。2. 本试验所分离的关中奶山羊骨髓间充质干细胞呈多角形、三角形或长梭形,类似于人和其他物种的间充质干细胞。3. 扫描电镜下,山羊骨髓间充质干细胞表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突,当多个细胞同时存在时,这些丝突相互搭接成网状。透射电镜下,山羊骨髓间充质干细胞的结构与其他物种基本相似,即表现为细胞内有大量扩张的粗面内质网、线粒体,分泌功能旺盛,具有该类细胞的典型特征:细胞核质比大、胞浆中细胞器少、核仁明显处于功能静息期。4. 免疫细胞化学分析表明,山羊骨髓间充质干细胞能够表达间充质干细胞的表面标志CD29、CD44、CD105、CD106 以及CD166(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34、CD45、c-kit (阴性),和其他物种的骨髓间充质干细胞相似。这些标志的检测有助于鉴定间充质干细胞。但本试验还发现,山羊骨髓间充质干细胞也表达TGF-α,其意义需要进一步阐明。5. 山羊骨髓间充质干细胞可以在体外用5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞表型,能够表达α-actin 抗原,呈PAS 染色阳性,并分泌糖原,从而为未来利用这种细胞进行心脏疾病细胞/基因治疗的模型研究提供了科学依据。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。6. 用HGF 和尼克酰胺向胰岛β-细胞诱导后,山羊骨髓间充质干细胞能够变为较典

论文目录:

文献综述

第一章 间充质干细胞概述

1.1 间充质干细胞在体内的分布

1.1.1 骨髓源间充质干细胞

1.1.2 脂肪源间充质干细胞

1.1.3 脐带血间充质干细胞

1.1.4 其他组织中的间充质干细胞

1.2 间充质干细胞及其微环境

1.2.1 间充质干细胞体外生长需要的基本条件

1.2.2 间充质干细胞生长有关的细胞因子

1.2.3 间充质干细胞与造血干细胞的关系

1.3 骨髓间充质干细胞分化的调控

1.3.1 骨髓间充质干细胞成骨分化的调控

1.3.2 骨髓间充质干细胞成软骨分化的调控

1.3.3 骨髓间充质干细胞增殖分化调控的研究

第二章 间充质干细胞的分离培养及鉴定方法

2.1 样品的采集及间充质干细胞的分离

2.1.1 骨髓样品的采集及其MSCs 的分离

2.1.2 脂肪样品的采集及其MSCs 的分离方法

2.1.3 脐血样品的采集及其MSCs 的分离方法

2.2 骨髓间充质干细胞的培养方法

2.2.1 材料

2.2.2 操作方法

2.3 间充质干细胞的体外扩增

2.3.1 培养基

2.3.2 影响骨髓MSCs 的体外培养扩增的因素

2.4 间充质干细胞的鉴定

2.4.1 间充质干细胞的形态学

2.4.2 MSCs 的表面标志

2.4.3 间充质干细胞的鉴定方法

2.5 间充质干细胞的冷冻保存及解冻复苏

2.5.1 间充质干细胞的冷冻保存

2.5.2 冻存间充质干细胞的解冻与复苏

2.5.3 冷冻前和解冻后间充质干细胞细胞活力及性能的检测

第三章 间充质干细胞的分化潜能

3.1 向中胚层细胞分化

3.1.1 MSCs 向成骨细胞分化

3.1.2 MSCs 向成软骨细胞分化

3.1.3 MSCs 向成脂肪细胞分化

3.1.4 MSCs 向心肌细胞分化

3.1.5 MSCs 向肌腱及骨骼肌细胞分化

3.2 向外胚层细胞分化

3.2.1 MSCs 向神经细胞分化

3.2.2 向表皮细胞分化

3.3 向内胚层细胞分化

3.3.1 MSCs 向肝系细胞分化

3.3.2 MSCs 向胰岛细胞分化

3.3.3 向血管内皮细胞分化

3.4 MSCs 向其他细胞分化

3.4.1 MSCs 分化为肾细胞

3.4.2 MSCs 分化为其他细胞类型

3-1 骨髓间充质干细胞体外诱导分化潜能

第四章 间充质干细胞的研究现状及应用前景

4.1 干细胞的永生化问题

4.1.1 端粒、端粒酶及端粒酶逆转录酶

4.1.2 细胞永生化应用研究的现状

4.1.3 体外培养干细胞永生化的条件

4.1.4 间充质干细胞永生化的意义

4.2 临床细胞/基因治疗

4.2.1 治疗骨骼及关节疾病

4.2.2 治疗心血管系统疾病

4.2.3 治疗血液及造血系统疾病

4.2.4 治疗糖尿病

4.2.5 治疗肝脏疾病

4.2.6 治疗肿瘤或中风

4.2.7 治疗神经系统疾病

4.2.8 生产嵌合体动物和转基因动物

4.2.9 先天性疾病的治疗

实验研究

前言

第五章 山羊骨髓MSCs 的分离及其基本特性研究

5.1 材料和方法

5.1.1 试验材料

5.1.2 试验仪器

5.1.3 方法

5.2 结果

5.2.1 不同方法分离所得山羊骨髓MSCs 的情况

5.2.2 山羊MSCs 的基本结构

5.2.3 山羊MSCs 的生长曲线和群体倍增时间

5.2.4 山羊MSCs 的细胞表面标志

5.3 讨论与分析

5.3.1 不同分离方法对山羊MSCs 数量及活力的影响

5.3.2 培养传代及冷冻和解冻对山羊MSCs 的影响

5.3.3 山羊骨髓MSCs 样细胞的形态学特点

5.3.4 山羊骨髓MSCs 的细胞表面标志的探讨

5.4 小结

第六章 山羊骨髓MSCs 诱导分化为心肌样细胞

6.1 材料与方法

6.1.1 试验材料

6.1.2 试验方法

6.2 结果

6.2.1 山羊MSCs 向心肌细胞诱导后的形态学

6.2.2 山羊MSCs 向心肌细胞诱导后的染色检测

6.3 讨论与分析

6.3.1 诱导培养基对细胞形态结构的影响

6.3.2 MSCs 向心肌样细胞诱导分化的机制及诱导后细胞的检测

6.3.3 MSCs 诱导分化为心肌样细胞的临床及实践意义

6.4 小结

第七章 山羊骨髓MSCs 诱导分化为神经样细胞

7.1 材料与方法

7.1.1 试验材料

7.1.2 试验仪器

7.1.3 试验方法

7.2 结果

7.2.1 山羊骨髓MSCs 向神经细胞诱导分化后细胞的形态

7.2.2 山羊骨髓MSCs 向神经细胞诱导分化后的免疫细胞化学染色

7.3 讨论与分析

7.3.1 不同浓度β-巯基乙醇对山羊MSCs 向神经细胞诱导分化的影响

7.3.2 不同诱导时间对山羊MSCs 向神经细胞诱导分化的影响

7.3.3 山羊MSCs 向神经细胞诱导分化后细胞表面标志的变化

7.4 小结

第八章 山羊骨髓MSCs 诱导分化为胰岛β-样细胞

8.1 材料与方法

8.1.1 试验材料

8.1.2 试验仪器

8.1.3 方法

8.2 结果

8.2.1 山羊骨髓MSCs 向胰腺诱导后细胞的形态学观察

8.2.2 山羊骨髓MSCs 诱导生成β-样细胞的检测

8.3 讨论与分析

8.3.1 诱导成分对山羊骨髓MSCs 向胰腺β-细胞分化的影响

8.3.2 诱导剂及刺激剂对山羊骨髓MSCs 形态和功能的影响

8.4 小结

第九章 山羊骨髓源MSCs 诱导分化为成骨细胞

9.1 材料与方法

9.1.1 试验材料

9.1.2 试验仪器

9.1.3 试验方法

9.2 结果

9.2.1 山羊骨髓MSCs 向成骨细胞诱导后的形态学观察

9.2.2 山羊骨髓MSCs 向成骨细胞诱导后的ALP 染色

9.2.3 山羊骨髓MSCs 向成骨细胞诱导后的茜素红染色

9.3 讨论与分析

9.3.1 山羊骨髓MSCs 诱导分化为成骨细胞的意义

9.3.2 诱导剂对山羊骨髓MSCs 形态改变及其成骨分化的影响

9.4 小结

结论

本研究的创新点

进一步研究的课题

致谢

参考文献

作者简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

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