菌酶协同处理豆粕制备饲用肽的研究

论文摘要

豆粕是大豆榨油后的副产品,粗蛋白含量在43-48%之间,必需氨基酸含量高、氨基酸组成合理,是目前使用最多、最广泛的植物性蛋白质原料。饲用肽泛指寡肽和小肽,是指由2个到50个氨基酸以肽键相连的化合物,相对分子质量在1-10 kD之间。本研究采用微生物法和酶解法处理豆粕制备饲用肽,将豆粕中的大分子蛋白降解成小分子肽,有效提高发酵豆粕产品中的肽含量,提高豆粕蛋白质消化率,从而改善豆粕营养价值,对弥补我国蛋白饲料尤其是优质蛋白资源的短缺,降低养殖业生产成本,促进畜牧业增产、增效具有重大的现实意义。本研究从实验室保藏的8株枯草芽孢杆菌中筛选到了1株能有效降解豆粕中大分子蛋白为小分子肽的菌株BSW-2,豆粕经过该菌发酵后,肽含量从原豆粕13.35mg/g提高到发酵后108.10 mg/g。同时,本研究还筛选到了1株能有效提高发酵豆粕粗蛋白含量的酵母菌YT,经过YT发酵后,粗蛋白从原料豆粕47.97%提高到55.32%。随后,通过正交试验建立了芽孢杆菌BSW-2、酵母菌YT混菌发酵豆粕的工艺,工艺条件为混合菌液接种量1.5%,料水比1：1.0,发酵温度30℃,发酵时间36 h。发酵后样品肽含量从发酵前的13.35 mg/g提高到184.57 mg/g,粗蛋白含量从47.62%提高到56.38%,蛋白质体外消化率从81.86%提高到91.99%,干物质体外损耗率从66.00%提高到71.40%,乳酸含量为2.65%,脲酶活性从0.45 U降低到0.15 U,抗原蛋白及大分子蛋白得到有效降解。另一方面,试验选择了中性蛋白酶作为豆粕酶解用酶,确定其酶解工艺为加酶量400u/g、料水比1：1.6、酶解温度50℃、酶解时间48 h。酶解豆粕样品肽含量从发酵前的13.35 mg/g提高到185.72 mg/g,粗蛋白含量从47.62%提高到52.59%,抗原蛋白及大分子蛋白也得到有效降解。最后,建立了菌酶协同处理豆粕的工艺,确定工艺条件为混合菌接种量1.5%、中性蛋白酶添加酶量450u/g、料水比1：1.4、处理温度40℃、处理时间48 h。在此条件下,豆粕经菌酶协同处理后,各项指标均优于混菌发酵和中性蛋白酶酶解,其中肽含量从13.35 mg/g提高到199.65 mg/g,粗蛋白含量从47.62%提高到56.72%,蛋白质体外消化率从81.86%提高到92.79%,干物质体外损耗率从66.00%提高到72.30%,乳酸含量为2.75%,脲酶活性从0.45 U降低到0.086 U,抗原蛋白及大分子蛋白得到有效降解。采用PCR-DGGE方法分析菌酶协同处理豆粕过程中细菌群落的变化,结果表明1.5%的接种量可以使枯草芽孢杆菌BSW-2从发酵开始就在整个发酵体系中占优势。随着发酵时间的延长,BSW-2的生长会抑制其它细菌的生长,到发酵后期整个发酵体系中,BSW-2占有绝对的优势。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 豆粕简介
• 1.1.1 豆粕的营养
• 1.1.2 豆粕蛋白质的组成
• 1.1.3 豆粕氨基酸
• 1.1.4 豆粕的抗营养因子
• 1.2 肽的研究
• 1.2.1 肽的概述
• 1.2.2 肽的功能
• 1.2.3 肽在养殖业中的应用
• 1.3 肽的生产制备工艺
• 1.3.1 化学水解法
• 1.3.2 酶解法
• 1.3.3 微生物发酵法
• 1.4 本课题研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 发酵原料
• 2.1.2 发酵菌种
• 2.1.3 蛋白酶
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 培养基
• 2.2 发酵豆粕芽孢杆菌的筛选
• 2.2.1 菌株活化
• 2.2.2 透明圈法初筛
• 2.2.3 芽孢杆菌的复筛
• 2.3 发酵豆粕酵母菌的筛选
• 2.3.1 菌株活化
• 2.3.2 酵母菌的筛选
• 2.4 芽孢杆菌BSW-2、酵母菌YT混菌发酵豆粕工艺条件的优化
• 2.4.1 液体种子的制备
• 2.4.2 豆粕发酵方法
• 2.4.3 接种量对肽含量的影响
• 2.4.4 料水比对肽含量的影响
• 2.4.5 发酵温度对肽含量的影响
• 2.4.6 发酵时间对肽含量的影响
• 2.4.7 芽孢杆菌BSW-2、酵母菌YT混菌发酵豆粕正交试验
• 2.5 酶解豆粕用酶的选择
• 2.6 中性蛋白酶酶解豆粕工艺条件的优化
• 2.6.1 豆粕酶解的方法
• 2.6.2 加酶量对肽含量的影响
• 2.6.3 料水比对肽含量的影响
• 2.6.4 酶解时间对肽含量的影响
• 2.6.5 酶解温度对肽含量的影响
• 2.6.6 豆粕中性蛋白酶酶解正交试验
• 2.7 芽孢杆菌、酵母菌、中性蛋白酶菌酶协同处理豆粕工艺条件的优化
• 2.7.1 菌酶协同处理豆粕的方法
• 2.7.2 接种量对肽含量的影响
• 2.7.3 加酶量对肽含量的影响
• 2.7.4 料水比对肽含量的影响
• 2.7.5 处理温度对肽含量的影响
• 2.7.6 处理时间对肽含量的影响
• 2.7.7 菌酶协同处理工艺正交试验
• 2.8 豆粕发酵样品评价指标测定方法
• 2.8.1 常规指标测定
• 2.8.2 肽含量的测定
• 2.8.3 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳法（SDS-PAGE）分析蛋白降解
• 2.8.4 饲料体外消化率的测定
• 2.9 变性梯度凝胶电泳技术分析菌酶混合处理豆粕细菌群落变化
• 2.9.1 原理
• 2.9.2 试验设计
• 2.9.3 发酵样品中细菌基因组总DNA的提取
• 2.9.4 16S rDNA V3高变区的PCR扩增
• 2.9.5 变性梯度凝胶电泳
• 2.9.6 回收条带PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 发酵豆粕芽孢杆菌的筛选
• 3.1.1 透明圈法初筛结果
• 3.1.2 芽孢杆菌的复筛
• 3.1.3 结论
• 3.2 发酵豆粕酵母菌的筛选
• 3.3 芽孢杆菌BSW-2、酵母菌YT混菌发酵豆粕工艺参数的优化
• 3.3.1 接种量对肽含量的影响
• 3.3.2 料水比对肽含量的影响
• 3.3.3 发酵温度对肽含量的影响
• 3.3.4 发酵时间对肽含量的影响
• 3.3.5 BSW-2、YT混菌发酵工艺优化正交试验
• 3.4 酶解豆粕用酶的选择
• 3.5 中性蛋白酶酶解豆粕工艺参数的优化
• 3.5.1 加酶量对肽含量的影响
• 3.5.2 料水比对肽含量的影响
• 3.5.3 酶解温度对肽含量的影响
• 3.5.4 酶解时间对肽含量的影响
• 3.5.5 中性蛋白酶酶解工艺优化正交试验
• 3.6 芽孢杆菌BSW-2、酵母菌YT、中性蛋白酶菌酶协同处理豆粕工艺条件优化
• 3.6.1 接种量对肽含量的影响
• 3.6.2 加酶量对肽含量的影响
• 3.6.3 料水比对肽含量的影响
• 3.6.4 处理温度对肽含量的影响
• 3.6.5 处理时间对肽含量的影响
• 3.6.6 菌酶协同处理工艺正交试验
• 3.7 发酵样品营养指标分析及比较
• 3.7.1 常规营养指标分析
• 3.7.2 氨基酸含量分析
• 3.7.3 大分子蛋白降解分析
• 3.8 菌酶协同处理豆粕过程中细菌群落的变化
• 4 讨论
• 4.1 肽的测定方法
• 4.2 发酵菌株的选择
• 4.3 蛋白酶的选择
• 4.4 菌酶协同处理豆粕工艺
• 4.5 关于工艺稳定性
• 4.6 PCR-DGGE分析豆粕发酵微生物群落变化
• 5 全文总结
• 5.1 发酵菌株的筛选
• 5.2 芽孢杆菌BSW-2、酵母菌YT混菌发酵豆粕工艺的建立
• 5.3 中性蛋白酶酶解豆粕工艺的建立
• 5.4 菌酶协同处理豆粕工艺的建立
• 5.5 PCR-DGGE分析菌酶协同处理豆粕过程中细菌群落变化
• 参考文献
• 致谢