氯胺酮噬菌体模拟表位酶联免疫吸附法（ELISA）的建立

论文摘要

氯胺酮，系苯环己哌啶（PCP）衍生物，于1962年首次人工合成，当初是作为PCP的替代品，消除PCP作为麻醉药的副作用，目前已成为一种新型麻醉药物。然而，自1971年美国旧金山和洛杉矶市首先报告的氯胺酮滥用病例以来，氯胺酮滥用迅速蔓延至周边国家。上个世纪90年代末，氯胺酮滥用流入日本，泰国等亚洲国家，并迅速蔓延到我国。近二十年来，我国滥用氯胺酮的比例连续攀升，香港特别行政区尤为严重。鉴于氯胺酮滥用全球化的严重性，建立准确、灵敏的检测方法十分必要。本研究主要内容如下：（1）噬菌体展示七肽库淘选氯胺酮模拟表位。以抗氯胺酮单克隆抗体为配体，在噬菌体七肽库中淘选氯胺酮的模拟表位，经四轮淘选后，随机挑取10个克隆，以间接非竞争ELISA和间接竞争ELISA确定模拟表位克隆5个。5个模拟表位克隆测序，结果获得4种序列，4种氯胺酮模拟表位的氨基酸序列分别为天冬酰胺-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苏氨酸-组氨酸，丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸-酪氨酸-精氨酸，苏氨酸-亮氨酸-颉氨酸-天冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸，赖氨酸-丙氨酸-脯氨酸-色氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-苏氨酸。（2）氯胺酮间接竞争ELISA检测方法的建立。氯胺酮间接竞争ELISA方法中最佳抗原包被浓度0.5μg／mL；抗体稀释倍数1：8000。获得了该方法的竞争抑制曲线，该方法检测氯胺酮IC50值为17.55 ng／mL，最低检测限为0.68 ng／mL。（3）噬菌体模拟表位间接竞争ELISA氯胺酮检测方法的建立。在噬菌体模拟表位间接竞争ELISA检测方法的建立过程中，包被抗体浓度为1：4000，竞争反应中噬菌体P1、P2、P3和P4稀释倍数分别为1：104、1：104、1：103和1：103，其中以P2建立的检测灵敏度最好。获得了以P2噬菌体模拟表位的竞争抑制曲线，该方法IC50值为27.27 ng／mL，最低检测限为1.55 ng／mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 理化性质
• 1.2 氯胺酮药学作用机理和毒副作用
• 1.2.1 药学作用机理
• 1.2.1.1 对N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体的拮抗用
• 1.2.1.2 与其他受体相互作用
• 1.2.2 毒副作用
• 1.3 氯胺酮检测研究进展
• 1.3.1 氯胺酮体内代谢
• 1.3.2 尿液中氯胺酮检测研究
• 1.3.3 血液中氯胺酮检测研究
• 1.3.4 毛发中氯胺酮检测研究
• 1.4 研究目的与意义
• 1.5 展望
• 第2章 噬菌体展示肽库淘选氯胺酮模拟表位的研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仪器和设备
• 2.1.3 主要试剂和培养基的配制
• 2.1.3.1 淘选部分
• 2.1.3.2 ELISA部分
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 E.coli ER2738菌株的保藏
• 2.2.2 E.coli ER2738菌株生长曲线的绘制
• 2.2.3 抗氯胺酮单克隆抗体的纯化
• 2.2.4 SDS-PAGE鉴定氯胺酮单克隆抗体
• 2.2.5 噬菌体展示肽库第一轮淘选方法
• 2.2.6 噬菌体扩增与纯化
• 2.2.7 噬菌体滴度测定
• 2.2.8 第二到四轮淘选方法
• 2.2.9 噬菌体单菌落的扩增
• 2.2.10 氯胺酮模拟表位的鉴定
• 2.2.10.1 间接非竞争ELISA方法检测噬菌体克隆
• 2.2.10.2 间接竞争ELISA方法鉴定氯胺酮模拟表位
• 2.2.11 噬菌体基因组DNA纯化与测序
• 2.2.12 琼脂糖凝胶电泳鉴定噬菌体基因组DNA
• 2.3 结果
• 2.3.1 抗氯胺酮单克隆抗体SDS-PAGE电泳结果
• 2.3.2 E.coli ER2738生长曲线
• 2.3.3 淘选回收率计算
• 2.3.4 氯胺酮模拟抗原表位噬菌体筛选结果
• 2.3.5 模拟表位噬菌体基因组DNA、随机插入序列测序结果分析
• 2.3.5.1 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果
• 2.3.5.2 模拟表位噬菌体插入DNA测序结果分析
• 2.3.5.3 模拟表位的计算机分析结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 洗脱时间对淘选的影响
• 2.4.2 减少非目的噬菌体出现机率的方法
• 2.5 小结
• 第3章 氯胺酮间接竞争ELISA检测方法的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 仪器和设备
• 3.1.3 主要试剂配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 间接非竞争ELISA实验方法的建立
• 3.2.2 酶标板均一性检测
• 3.2.3 间接竞争ELISA实验方法的建立
• 3.2.4 间接竞争ELISA最佳条件的优化
• 3.2.4.1 包被条件的优化
• 3.2.4.2 封闭液的优化
• 3.2.4.3 HRP标记抗IgG抗体反应时间的优化
• 3.2.4.4 棋盘滴定法确定最佳抗原包被浓度和最佳抗体稀释倍数
• 3.2.5 间接竞争ELISA检测氯胺酮标准曲线的制作
• 3.2.6 交叉反应实验
• 3.2.7 精密度
• 3.2.8 灵敏度与最低检出限
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 酶标板均一性的检测
• 3.3.2 间接竞争ELISA方法最佳条件的优化
• 3.3.2.1 最佳包被条件的确定
• 3.3.2.2 最佳封闭液的确定
• 3.3.2.3 HRP标记抗IgG抗体最佳反应时间的确定
• 3.3.2.4 抗原最佳包被浓度与抗体最佳稀释倍数确定
• 3.3.2.5 最佳实验条件确定
• 3.3.4 标准曲线的制作
• 3.3.5 交叉反应实验
• 3.3.6 精密度
• 3.3.7 灵敏度和最低检出限
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 噬菌体模拟表位间接竞争ELISA方法的建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 仪器和设备
• 4.1.3 主要试剂配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 间接非竞争ELISA实验方法的建立
• 4.2.2 间接竞争ELISA实验方法的建立
• 4.2.3 间接竞争ELISA最佳条件的优化
• 4.2.3.1 包被条件的优化
• 4.2.3.2 封闭液的优化
• 4.2.3.3 HRP标记抗M13单克隆抗体反应时间的优化
• 4.2.3.4 棋盘滴定法确定最佳抗原包被浓度和最佳抗体稀释倍数
• 4.2.4 间接竞争ELISA检测氯胺酮标准曲线的制作
• 4.2.5 灵敏度与最低检出限
• 4.2.6 精密度
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 间接竞争ELISA方法最佳条件的确定
• 4.3.1.1 最佳包被条件的确定
• 4.3.1.2 最佳封闭液的确定
• 4.3.1.3 HRP标记抗M13单克隆抗体最佳反应时间的确定
• 4.3.1.4 抗氯胺酮单克隆抗体最佳包被浓度与噬菌体最佳稀释倍数确定
• 4.3.1.5 最佳实验条件确定
• 4.3.2 标准曲线的制作
• 4.3.3 灵敏度和最低检出限
• 4.3.4 精密度
• 4.4 讨论
• 4.4.1 噬菌体保存实验探讨
• 4.4.2 模拟表位分析
• 4.5 小结
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果