论文摘要
中药吴茱萸来源于芸香科（Rutaceae）吴茱萸属（Evodia）植物吴茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.） Benth.、疏毛吴茱萸Evoida rutaecarpa（Juss.） Benth.var.bodinieri（Dode） Huang和石虎Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang的干燥近成熟果实,是我国常用的大宗中药材。吴茱萸药材基原植物、自然资源丰富且分布较广,但由于各地吴茱萸生境差异很大,生态条件复杂,栽培广泛；数千年来各地间种质资源交流频繁；各地风俗迥异,用药习惯差别较大且吴茱萸属内种和变种较多等原因造成了吴茱萸遗传变异复杂,遗传背景不明确。至今人们对吴茱萸种内间的演化关系及栽培种间的亲缘关系以及不同基原的正品药材的质量评价尚不清晰。此外,吴茱萸生长过程中易受到干旱胁迫,导致植株体内活性氧累积过多,活性氧清除系统失调,对植物生长和药材品质带来严重的不良影响。所以,针对吴茱萸的种质资源多样性和抗旱生理进行基础研究,这对吴茱萸资源的保护和可持续利用、促进吴茱萸药材产业化生产的良好发展、保证吴茱萸药材质量以及临床用药的安全性等方面都具有重要的科学意义和现实意义。目的：尽管前人采用AFLP、RAPD等分子标记技术对吴茱萸种质资源遗传多样性进行了研究,但由于受到样本数量和样本来源地的限制,没有广泛收集其它吴茱萸主产区的种质,因此其遗传多样性分析具有一定的局限性。本研究广泛收集吴茱萸正品药材基源植物的栽培种和药材,分析了它们的种质资源遗传多样性,构建了HPLC化学指纹图谱,客观的评价了吴茱萸种质资源,进一步探讨了其遗传多样性,为阐明吴茱萸栽培种的亲缘关系提供了科学的实验依据。吴茱萸在生长过程中易受干旱胁迫,严重影响药材质量和产量。目前,干旱胁迫的抵御机制研究主要集中在农作物上,药用植物相关研究较少,还未见吴茱萸抗旱生理研究的报道。本实验利用人为模拟的干旱胁迫环境,研究了吴茱萸扦插苗在受到干旱胁迫和复水过程各项生理生化指标的变化规律并克隆了抗逆关键基因—Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因的全长序列,为下一步深入研究奠定了坚实的基础。方法：1.文献研究检索与本研究相关的古籍和国内外文献,并进行了总结和综述,概括了与本论文相关的研究动态。主要包括以下4个方面：（1）吴茱萸药用历史、资源分布、性味功效与应用、吴茱萸植物特征与品种鉴别等吴茱萸本草考证概况；（2）吴茱萸植物形态学标记、细胞学分析、DNA分子标记和DNA条形码等吴茱萸植物种质资源多样性研究进展；（3）干旱胁迫环境下植物细胞渗透调节物质和活性氧（ROS）清除系统及植物SOD研究进展；（4）吴茱萸化学成分、化学指纹图谱等吴茱萸化学质量评价研究进展。2.实验研究本文利用DNA分子标记技术、DNA条形码技术、分析化学方法对不同来源地和产地的吴茱萸种质资源及药材进行了多样性评价；并且,对吴茱萸扦插苗在人工模拟的干旱胁迫环境条件下,植株内多种生理生化指标变化规律及SOD基因的克隆进行了研究。本文研究内容包括：（1）采用ISSR分子标记技术对来源于贵州省、江西省、湖南省、湖北省、广东省的71份栽培吴茱萸属植物种质资源进行了遗传多样性研究分析。（2）采用ITS2DNA条形码技术分析了代表不同来源地、不同种的吴茱萸属植物样品18份。（3）使用HPLC法测定了绿原酸、异鼠李素-3-O-半乳糖苷、槲皮素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸新碱等6种有效成分的含量并构建了37个批次的吴茱萸药材HPLC化学指纹图谱。（4）使用不同浓度PEG—-6000溶液,经过不同时间处理吴茱萸扦插苗,测定可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等生理生化指标。（5）采用同源克隆法克隆了吴茱萸Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因的核心片段,根据片段序列设计特异性引物。使用3’,5’-末端快速扩增（RACE）技术克隆了上述2个基因的全长cDNA序列。成果：通过完成上述实验研究后,本论文取得了以下成果：（1）吴茱萸栽培种种质资源遗传多样性ISSR分析实验获得了以下实验结果。贵州省吴茱萸居群的遗传多样性比江西省石虎居群的遗传多样性丰富；贵州省石虎居群的遗传多样性较高；不同产地居群遗传多样性从高到低依次为：7,10,1,11,9,3,6,2,4,吴茱萸药材3个基原品种群的遗传多样性从高到低依次为：吴茱萸,石虎和疏毛吴茱萸；不同产地及不同种群群体分化程度都较大,尤其是不同产地居群间,Gst达到了0.8164,不同品种群间的Gst为0.6898,而基因流的计算结果刚好相反,不同产地居群Nm小于不同种群,但是两者的基因流都较弱,可能与吴茱萸的繁殖方式多为扦插繁殖有关,同时生长环境的条件也有一定影响。UPGMA聚类表明,基于ISSR的遗传多样性分析不仅可以将正品吴茱萸基原植物与伪品—楝叶吴茱萸区分开,还能将不同吴茱萸药材不同基原种甚至是不同产地的样本进行有效分辨,显示了它们之间的亲缘关系,遗传距离和聚类分析表明,基于ISSR的遗传多样性分析是研究吴茱萸属植物栽培种亲缘关系和品种鉴定的可靠手段。（2）吴茱萸种质资源ITS2DNA条形码实验获得了以下实验结果。ITS2序列长度均为220bp,共产生了17个单核苷酸（SNP）变异位点,占序列总长的7.73%,其中特异性位点7个。石虎与吴茱萸的种间遗传距离最近为0.036,疏毛吴茱萸与石虎的种间遗传距离最远为0.039。基原物种与楝叶吴茱萸的K2-P距离分布在0.042—0.067之间,疏毛吴茱萸与楝叶吴茱萸遗传距离最远,吴茱萸与楝叶吴茱萸遗传距离最近。邻接法（NJ）构建的吴茱萸属植物系统聚类树显示：18个样品主要分成3大支,楝叶吴茱萸单独形成一个分支,亲缘关系与吴茱萸3个基原种植物较远。（3）药材含量测定实验获得了以下实验结果,吴茱萸和疏毛吴茱萸的吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱等生物碱含量较石虎高,表现出与海拔高度呈正相关的趋势,而绿原酸、异鼠李素-3-O-半乳糖苷、槲皮素等非生物碱类物质则没有表现出上述的规律。HPLC化学指纹图谱实验获得了以下实验结果。10批次江西吴茱萸样品有19个共有峰,保留时间的RSD均小于0.4%,而峰面积的RSD比较大,说明江西省吴茱萸药材在化学成分的组成上基本一样,但是组分的量上存在差异。贵州省余庆县龙溪镇、贵州省石阡县白沙镇、贵州省石阡县白沙镇、贵州省松桃县正大乡、湖北、湖南样品指纹图谱与江西对照指纹图谱相似度为0.952、0.969、0.967、0.965,0.874,0.973,由此可知,吴茱萸和石虎两个不同种的相似度较高,说明两品种的吴茱萸药材品质较为一致。HPLC化学指纹图谱欧氏距离矩阵与ISSR分子标记遗传相似系数矩阵相关系数为0.469,相关性不显著。（4）吴茱萸扦插苗干旱胁迫实验获得了以下实验结果。叶片可溶性蛋白含量变化总体趋势为：随胁迫强度和时间延长而呈先上升后下降,复水过程中,可溶性蛋白含量缓慢下降,但均高于胁迫状态时的含量。叶片可溶性糖含量变化总体趋势为：随胁迫强度和时间延长一直呈上升趋势,复水过程中,可溶性糖含量呈明显下降趋势,但均比CK高,不能恢复到CK水平。叶片游离脯氨酸含量变化总体趋势为：随胁迫强度和时间延长一直呈上升趋势,复水过程中,其含量较胁迫时均呈迅速下降趋势,但随着复水时间延长,其含量又缓慢上升。叶片MDA变化总体趋势为：随胁迫强度和时间延长一直呈上升趋势,复水过程中,除了在重度胁迫时,胁迫7d后复水条件下,MDA含量继续上升外,MDA含量较胁迫时均呈下降状态。叶片SOD活性变化总体趋势为：随胁迫强度和时间延长一直呈上升趋势,复水过程中,前期SOD活性继续升高,后期活性缓慢下降。叶片CAT活性变化总体趋势为：随胁迫强度呈先上升后下降的趋势,复水过程中,随时间延长而缓慢上升。叶片POD活性变化总体趋势为：随胁迫强度和时间延长一直呈上升趋势,复水过程中,短时间迅速下降,随时间延长降幅减缓,但均不能恢复到CK水平。（5）吴茱萸Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因克隆实验获得了以下实验结果。吴茱萸Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列为717bp,开放阅读框长459bp,编码152个氨基酸,GenBank登录号为JQ285851。该基因编码的氨基酸分子量为15142.7Da,理论等电点pI为5.47,属亲水性酸性氨基酸,为稳定类蛋白。吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA序列为1048bp,开放阅读框长687bp,编码229个氨基酸,GenBank登录号为JQ285852。该基因编码的氨基酸分子量为25434.1Da,理论等电点pI为7.16,属亲水性碱性蛋白,为稳定类蛋白。结论：71份不同品种、不同来源地的吴茱萸属植物种质资源遗传多样性ISSR分析和DNA条形码ITS2区段分析的实验结果均证明了吴茱萸药材3个基原种中,石虎和疏毛吴茱萸的亲缘关系较为接近,但还是受到产地、环境和繁殖方式的影响而有所分化。ISSR标记和ITS2DNA条形码能作为吴茱萸及其种内变异种类有效鉴别的方法。吴茱萸药材HPLC化学指纹图谱证明了石虎药材和疏毛吴茱萸药材所含化学成分和含量相当,从化学成分方面证实了两者亲缘关系接近,与分子标记的实验结果一致。但HPLC指纹图谱聚类分析与ISSR聚类、ITS2聚类结果不完全一致,表明药用植物次生代谢产物积累可能受环境条件和种植水平等客观因素影响较大。HPLC含量测定结果表明,吴茱萸药材生物碱含量高低与栽培地海拔高度呈正相关趋势。石虎扦插苗干旱胁迫和复水过程中植株体内细胞渗透调节物质和活性氧清除系统变化规律的实验证明了在逆境条件下细胞渗透调节物质和活性氧清除系统并不是同步运行的,变化规律复杂,其中可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸含量及POD活性呈先上升后下降的变化趋势,MDA含量和SOD活性一直呈上升趋势,CAT活性呈现“N”型变曲线变化,即先上升后下降再上升的趋势。吴茱萸SOD基因克隆实验证明了吴茱萸Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因与其他植物同类基因的相似度较高。该实验为下一步研究SOD基因调控对吴茱萸抗旱强弱的影响及抗旱优良品种选育打下基础。