BMI-1在肿瘤发生中的机制研究

论文摘要

第一部分实时荧光定量RT-PCR检测BMI-1 mRNA在白血病细胞中的表达目的建立SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测白血病细胞中BMI-1 mRNA。方法在TRIzol提取总RNA后,将mRNA逆转录成cDNA,再用SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法检测BMI-1mRNA在白血病细胞系（K562、HL-60、Daudi、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1）、10例AML初治患者的骨髓ACDA抗凝标本和8例健康体检者的外周血EDTA抗凝标本中的表达,扩增产物的特异性通过熔解曲线和凝胶电泳双重确认,以ABL为内参照,采用2-△△ct法计算相对表达量。结果⑴BMI-1mRNA在白血病细胞系（K562、HL-60、Daudi、Jurkatt、Molt-4、U937和THP-1）均存在表达,其中U937表达最高,而HL-60表达最低。⑵与健康体检者的外周血白细胞相比,BMI-1mRNA在白血病细胞中的表达显著升高（P < 0.01）。结论⑴SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR是一种快速有效、灵敏度高、特异性良好的定量检测BMI-1 mRNA的方法。⑵BMI-1参与白血病的发生,可能是一种新的肿瘤分子标记物。第二部分BMI-1-pEGFP真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达目的构建并鉴定真核表达载体BMI-1-pEGFP,观察其在人类宫颈癌细胞系Hela中的过表达以及对细胞周期和可能的下游基因表达的影响。方法将BMI-1逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）产物克隆入真核表达载体pEGFP-N1,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建BMI-1-pEGFP真核表达载体;采用脂质体转染法,将质粒BMI-1-pEGFP DNA转染Hela细胞,荧光显微镜观察其表达,实时荧光定量RT-PCR方法检测转染前后Hela细胞中BMI-1、P16INK4a、hTERT、HOXA9、HOXB4和HOXC13 mRNA的表达变化,Western Blot检测BMI-1蛋白的表达变化,PI染色FACS检测转染前后Hela细胞的细胞周期变化。结果⑴重组真核表达载体BMI-1-pEGFP已成功载入BMI-1的全长编码基因（除终止密码子外）,序列测定的结果与预期设计完全一致。⑵荧光显微镜下可见在转染BMI-1-pEGFP融合基因的Hela细胞中存在荧光分布;实时荧光定量RT-PCR检测BMI-1mRNA表达平均升高约1260倍,Western Blot检测发现存在外源性的融合蛋白BMI-1-EGFP的表达。⑶在Hela细胞中过表达BMI-1显著下调P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表达,分别为对照组的9.2%、10.9%和69.7%（P < 0.01）,而hTERT和HOXB4两者mRNA的表达量无明显变化。⑷BMI-1-pEGFP转染Hela细胞后,G1期细胞由65.68%减少至50.53%,S期细胞由27.17%增加到29.59%,G2/M期细胞数目变化不明显。结论⑴成功构建了真核表达质粒BMI-1-pEGFP。⑵BMI-1-pEGFP转染Hela细胞后过表达BMI-1显著下调P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表达,而hTERT和HOXB4两者mRNA的表达量无显著改变;同时G1期细胞减少,S期细胞增加,这可能是BMI-1参与宫颈癌发生的机制之一。第三部分BMI-1shRNA真核表达载体的构建、鉴定及其在Hela细胞中的表达目的针对BMI-1基因的不同部位构建4种不同的BMI-1 shRNA真核表达载体BMI-1 shRNA1、2、3、4,转染人类宫颈癌细胞系Hela筛选有效序列,并进一步应用G418抗性筛选稳定转染细胞株,观察BMI-1在Hela细胞中的下调以及其对细胞周期和可能的下游基因表达的影响。方法用DNA重组技术将针对人BMI-1基因的不同部位所设计的4对shRNA序列克隆到真核表达质粒psiRNA-hH1neo中,构建BMI-1 shRNA表达载体BMI-1 shRNA1、2、3、4,用阳离子脂质体介导转染Hela细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞株。实时荧光定量RT-PCR方法检测转染前后Hela细胞中BMI-1、P16INK4a、hTERT、HOXA9、HoxB4和HOXC13 mRNA的表达变化,Western Blot检测BMI-1蛋白的表达变化,PI染色FACS检测转染前后Hela细胞的细胞周期变化。结果⑴4种shRNA表达载体BMI-1 shRNA1、2、3、4经测序鉴定证明插入正确。⑵在Hela细胞中转染BMI-1 shRNA1、2、3、4,实时荧光定量RT-PCR检测BMI-1 mRNA表达发现只有BMI-1shRNA 2和4能显著下调BMI-1mRNA的表达,分别为对照组的40.1%、32.6%,抑制率分别为59.9%和67.4%,BMI-1蛋白的表达量明显下降。⑶稳定转染BMI-1shRNA 2、4的Hela细胞中P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表达分别上调9-12倍、13-14倍、7-8倍,而hTERT和HOXB4两者的mRNA表达量无变化变化。⑷BMI-1shRNA2和4转染Hela细胞后,G1期细胞增加,S期细胞减少。结论⑴成功构建了真核表达载体BMI-1shRNA1、2、3、4。⑵BMI-1shRNA 2和4能有效地抑制BMI-1在Hela细胞中的表达;而在Hela细胞下调BMI-1能显著上调P16INK4a、HOXA9和HOXC13的表达,同时导致G1期细胞增加,S期细胞减少,为宫颈癌的基因治疗提供一条新思路。第四部分过表达BMI-1对MDA-MB-231、MCF-7、K562、Jurkat的影响目的将第二部分构建成功的真核表达载体BMI-1-pEGFP分别转染人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7、人类白血病细胞系K562和Jurkat,分别观察BMI-1在MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat细胞中的过表达以及对可能的下游基因表达的影响。方法采用脂质体转染法,将质粒BMI-1-pEGFP DNA转染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat细胞并筛选稳定转染细胞株,Western Blot检测BMI-1蛋白的表达变化,实时荧光定量RT-PCR检测其中BMI-1、P16INK4a、hTERT、HOXA9、HOXB4和HOXC13 mRNA的表达变化。结果⑴荧光显微镜下可见在转染BMI-1-EGFP融合基因的MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat细胞中存在荧光分布,BMI-1mRNA的表达水平分别平均升高78.63、65.72、43.25和36.78倍,Western Blot检测发现存在外源性的融合蛋白BMI-1-EGFP的表达。⑵在MDA-MB-231和MCF-7细胞中过表达BMI-1分别平均上调hTERT mRNA的表达36.53倍和27.33倍,分别下调P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表达为各自对照组的62.8%和57.4%、65.7%和63.5%、73.5%和69.3%,而MCF-7细胞中不表达HOXB4mRNA,后者在MDA-MB-231细胞中的表达量无明显改变。⑶在K562和Jurkat细胞中过表达BMI-1能显著下调HOXC13 mRNA的表达,分别为各自对照组的64.8%和67.2%,而HOXB4 mRNA的表达量无明显变化, K562和Jurkat细胞不表达P16INK4a和HOXA9 mRNA。结论⑴真核表达质粒BMI-1-pEGFP转染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat细胞能表达融合蛋白BMI-1-EGFP。⑵在MDA-MB-231和MCF-7细胞中过表达BMI-1显著上调hTERT mRNA的表达,下调P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表达,这可能是BMI-1参与乳腺癌发生的机制之一。⑶在K562和Jurkat细胞中过表达BMI-1显著下调HOXC13 mRNA的表达,HOXB4mRNA的表达量无显著改变,这可能是BMI-1参与白血病发生的机制之一。第五部分BMI-1沉默对MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat细胞的抑制作用目的将第三部分构建成功并鉴定的真核表达载体BMI-1 shRNA2、4分别转染人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7、人类白血病细胞系K562和Jurkat,分别观察BMI-1在MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat细胞中的下调以及对可能的下游基因表达的影响。方法采用脂质体转染法,将质粒BMI-1 shRNA 2、4 DNA转染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat细胞并筛选稳定转染细胞株,Western Blot检测BMI-1蛋白的表达,实时荧光定量RT-PCR检测其中BMI-1、P16INK4a、hTERT、HOXA9、HOXB4和HOXC13 mRNA的表达变化。结果⑴稳定转染BMI-1 shRNA 2、4的MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat细胞中BMI-1mRNA的表达水平分别降低为各自对照组的34.2%和28.6%、36.5%和32.1%、42.5%和35.4%、40.8%和34.6%,BMI-1蛋白表达分别降低为各自对照组的40.9%和35.6%、42.7%和38.5%、45.6%和37.6%、43.4%和36.8%。⑵稳定转染BMI-1 shRNA 2、4的MDA-MB-231和MCF-7细胞中hTERT mRNA的表达分别降低为各自对照组的65.2%和59.6%、62.7%和58.4%;P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表达水平分别升高7-9倍、10-12倍、6-8倍,而MCF-7细胞中不表达HOXB4 mRNA,后者在MDA-MB-231细胞中的表达量无明显变化。⑶K562和Jurkat细胞不表达P16INK4a和HOXA9 mRNA,稳定转染BMI-1 shRNA 2、4的K562和Jurkat细胞中HOXC13 mRNA的表达水平分别升高8-10倍、9-11倍,而HOXB4mRNA的表达量无明显改变。结论⑴真核表达质粒BMI-1 shRNA2、4转染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat细胞能显著下调BMI-1 mRNA和蛋白质的表达。⑵稳定转染BMI-1 shRNA 2、4的MDA-MB-231和MCF-7细胞中hTERT mRNA的表达显著下调,而P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表达则显著上调。⑶稳定转染BMI-1 shRNA 2、4的K562和Jurkat细胞中HOXC13 mRNA的表达显著上调,而HOXB4mRNA的表达量无显著改变。⑷BMI-1可能是乳腺癌、白血病基因治疗的一个新靶点。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 实时荧光定量 RT-PCR 检测 BMI-1 mRNA 在白血病细胞中的表达
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 BMI-1-pEGFP 真核表达载体的构建及其在 Hela 细胞中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 BMI-1 shRNA 真核表达载体的构建、鉴定及表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 过表达 BMI-1 对 MDA-MB-231、MCF-7、K562、Jurkat 细胞的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第五部分 BMI-1 沉默对 MDA-MB-231、MCF-7、K562 和 Jurkat 细胞的抑制作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 在校期间发表的文章
• 致谢