盐酸克伦特罗抗血清的制备及ELISA检测方法的初步建立

论文摘要

为了弥补当前市场上盐酸克伦特罗（CLB）快检方法所存在的缺陷,尤其是以单克隆抗体为基础操作周期长、专业技术要求高等不足之处,本实验利用人工合成抗原BSA-CLB免疫日本大耳白家兔获得了含盐酸克伦特罗抗体的抗血清,并对其进行效价鉴定,在此基础上初步建立了盐酸克伦特罗的酶联免疫吸附检测方法,从而为进一步应用于市场检测奠定了基础。首先,本研究采用正交试验方法,利用重氮化反应原理将CLB和卵清白蛋白OVA、牛血清白蛋白BSA偶联工艺进行优化,分析了各因素对偶联反应的影响机理,并在得出的最佳条件下合成了高偶联率的免疫抗原BSA-CLB和包被抗原OVA-CLB,通过紫外可见全波长扫描分析显示偶联前后载体蛋白的吸收峰发生了很大改变。以经过改进的偶联率计算方法计算得出OVA-CLB和BSA-CLB的偶联率分别为29:1和52.3:1。以免疫抗原BSA-CLB免疫日本大耳白家兔。免疫期间,以OVA-CLB包被酶标板,采用间接非竞争酶联免疫吸附实验检测血清效价,并根据检测结果决定放血时间。免疫四个月后,获得的血清效价最高达到1:640000。最后,本实验利用免疫所得的抗血清,采用间接非竞争ELISA方法比较不同OVA-CLB包被量、不同抗血清及二抗稀释度等对检测结果的影响,确立了最佳检测条件。并在此条件下根据检测标准曲线及灵敏度情况对检测体系的pH值、离子强度、反应时间等进行优化,最终初步建立了以包被OVA-CLB为基础的间接竞争性ELISA检测CLB的方法,检测灵敏度高达0.013μg/mL,标准曲线的线性拟合度高,而且该方法的包被酶标板稳定性、重复性较市售酶标板好,显示出很好的市场应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 盐酸克伦特罗概述
• 1.1.1 盐酸克伦特罗的理化性质及药理作用
• 1.1.2 盐酸克伦特罗的残留
• 1.1.3 盐酸克伦特罗的危害
• 1.1.4 盐酸克伦特罗的检测技术
• 1.2 酶联免疫吸附检测技术
• 1.2.1 抗原
• 1.2.2 抗体
• 1.2.3 免疫
• 1.2.4 酶联免疫吸附检测
• 1.3 本文研究的主要内容
• 第二章 盐酸克伦特罗完全抗原的制备及偶联工艺优化
• 2.1 原理
• 2.2 试剂与仪器
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 盐酸克伦特罗的活化
• 2.3.2 包被抗原OVA-CLB的偶联正交试验
• 2.3.3 偶联物的鉴定
• 2.3.4 偶联比例的计算
• 2.3.5 单因素影响试验
• 2.3.6 免疫抗原BSA-CLB的偶联
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 偶联产物的鉴定
• 2.4.2 包被抗原合成的正交实验结果
• 2.4.3 单因素影响试验结果
• 2.4.4 偶联比例的计算
• 2.5 小结
• 第三章 动物免疫
• 3.1 原理
• 3.2 试剂与仪器
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 分组与标记
• 3.3.2 免疫家兔
• 3.3.3 放血
• 3.3.4 分离血清
• 3.3.5 抗血清的纯化
• 3.3.6 酶联免疫吸附法检测血清效价（间接法）
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 抗原包被浓度的确定
• 3.4.2 抗血清效价的检测
• 3.4.3 ELISA方法检测血清效价的可行性分析
• 3.5 小结
• 第四章 盐酸克伦特罗检测方法的初步建立
• 4.1 原理
• 4.2 试剂与仪器
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 间接性酶联免疫吸附检测（条件优化）
• 4.3.2 酶联免疫吸附检测（间接竞争法）CLB方法的初步建立
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 包被抗原与抗血清的最适工作浓度筛选
• 4.4.2 包被抗原进行细化筛选试验
• 4.4.3 封闭液浓度的筛选试验
• 4.4.4 辣根过氧化物酶标记羊抗兔稀释度筛选
• 4.4.5 底物液优化试验
• 4.4.6 反应缓冲液pH值优化试验
• 4.4.7 反应缓冲液离子强度优化试验
• 4.4.8 反应时间优化试验
• 4.4.9 最低检出限及定量限
• 4.4.10 标准曲线的绘制
• 4.4.11 特异性试验
• 4.4.12 稳定性试验
• 4.4.13 重复性试验
• 4.5 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢