水稻OsELF3基因RNAi载体的构建及其转化研究

论文摘要

水稻是人类赖以生存的粮食作物之一,其抽穗期是重要的农艺性状,决定品种种植的生态区和地区适应性,也是重要的育种目标,选育早熟高产的水稻品种一直为水稻育种家所重视。植物生育期调控是一个复杂的过程,涉及许多基因。ELF3基因是拟南芥昼夜节律钟的正向调节因子,在光感受器和中心振荡器之间起作用,并维持生理节律系的生存能力以便获得正确的振幅和周期。该基因的突变使得对光周期敏感性和节律调控作用丧失,在长日和短日条件下均表现为早花。在水稻中,通过蛋白质的在线比对发现,预测的OsELF3所编码的蛋白与拟南芥ELF3具有很强的序列相似。推测它具有调控水稻抽穗期的功能。RNA干涉（RNA interference, RNAi）技术作为一项新的生物学技术,能通过基因转录后的调控,抑制特定基因的表达,此方法的优点在于只改变目的基因,而不改变植物本身的遗传背景。作为一种简单的、有效的代替基因敲除的遗传工具。本研究成功构建水稻OsELF3基因RNAi表达载体pOsAct2-OsELF3-RNAi,以中花11、日本晴为受体,利用农杆菌介导的方法获得有价值的转基因植株。获得的RNAi材料为水稻OsELF3的深入研究奠定了基础。主要研究结果如下1根据Gramene上的OsELF3基因cDNA序列设计引物,分别进行PCR反应,扩增了约678bp大小的RNAi-Sence片段和RNAi-Antisence片段。2将OsELF3基因RNAi片段克隆到植物表达载体pOsAct2-I-nos上,得到RNAi表达载体pOsAct2-OsELF3-RNAi。受Actin2启动子调控,选择标记为潮霉素（Hpt）基因。3将构建好的RNAi表达载体pOsAct2-OsELF3-RNAi利用农杆菌介导的方法导入中花11、日本晴成熟胚诱导的胚性愈伤组织中,经组织培养,抗性筛选分化,获得再生植株。4利用离体叶片潮霉素快速鉴定、PCR扩增Hpt基因对转基因植株进行鉴定,证实了OsELF3基因RNAi片段正确插入到水稻基因组中,成功获得了12株阳性转基因水稻。5对OsELF3基因RNAi T,代阳性植株和对照中花11、日本晴的性状调查结果表明,OsELF3基因RNAi T1代相比中花11、日本晴抽穗期延迟,统计分析表明,差异显著。OsELF3基因的RNAi转基因水稻的获得为进一步研究OsELF3基因的功能提供了重要材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 拟南芥开花的分子机理
• 1.1 受光周期影响的途径
• 1.2 春化途径
• 1.3 GA途径
• 1.4 自主调控开花途径
• 2 水稻抽穗期基因研究现状
• 2.1 水稻抽穗期的光温生态特性
• 2.1.1 感光性
• 2.1.2 感温性
• 2.1.3 基本营养生长性
• 2.2 抽穗期的遗传控制
• 2.3 水稻抽穗期相关基因的克隆和功能研究
• 2.3.1 Hd1
• 2.3.2 Hd6
• 2.3.3 Hd3a
• 2.3.4 Ehd1
• 2.3.5 Ghd7
• 2.3.6 Se5
• 3 RNAI技术的原理及应用
• 3.1 RNAi的分子作用机理
• 3.2 RNAi技术的应用
• 3.2.1 高通量地研究基因功能
• 3.2.2 基因治疗
• 3.2.3 基因表达调控
• 3.2.4 作物遗传改良
• 3.2.4.1 RNAi技术在作物品质改良方面的应用
• 3.2.4.2 RNAi技术在作物抗病虫方面的应用
• 4 本论文研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 供试水稻品种
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 培养基成分
• 1.5.1 细菌培养基的配制
• 1.5.2 适用于水稻的培养基
• 2 试验方法
• 2.1 水稻OsELF3基因RNAi表达载体的构建及检测
• 2.1.1 水稻材料RNA的提取
• 2.1.2 cDNA第一链的合成
• 2.1.3 OsELF3基因干涉片段扩增
• 2.1.4 PCR产物的纯化和回收
• 2.1.5 水稻OsELF3基因干涉片段与克隆载体的连接
• 2.1.6 大肠杆菌感受态的制备
• 2.1.7 大肠杆菌转化
• 2.1.8 阳性克隆的筛选和鉴定
• 2.1.9 质粒的提取
• 2.1.10 DNA测序及核苷酸序列分析
• 2.1.11 OsELF3基因干涉中间载体构建
• 2.1.12 干涉载体pOsAct2-OsELF3-RNAi的构建及检测
• 2.2 农杆菌介导水稻OsELF3基因RNAi表达载体的转化
• 2.2.3 农杆菌感受态的制备
• 2.2.4 重组质粒对农杆菌的转化
• 2.2.5 工程农杆菌的鉴定
• 2.2.6 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 2.2.6.1 愈伤组织的诱导
• 2.2.6.2 农杆菌菌株的活化
• 2.2.6.3 共培养转化
• 2.2.6.4 抗性愈伤组织筛选
• 2.2.6.5 分化与生根
• 2.2.7 转基因植株的分子生物学检测
• 2.2.7.1 植物基因组DNA的提取
• 2.2.7.2 转化植株的PCR检测
• 2.2.8 转化植株叶片的潮霉素抗性鉴定
• 2.2.9 抽穗期调查
• 第三章 结果与分析
• 1 水稻OsELF3基因RNAI载体的构建
• 1.1 RNA提取和检测
• 1.2 OsELF3基因干涉片段扩增
• 1.3 Sence、Anti-Sence片段与pSK载体连接重组子的鉴定
• 1.4 Sence、Anti-Sence片段插入pOsAct2-1-nos载体后BamHI和SalI双酶切鉴定
• 2 农杆菌介导水稻OsELF3基因表达载体的转化
• 2.1 转化农杆菌的鉴定
• 2.2 转OsELF3基因RNAi表达载体水稻植株的获得
• 0代转基因植株的PCR检测'>2.3 T₀代转基因植株的PCR检测
• 0代转化植株叶片的潮霉素抗性鉴定'>2.4 T₀代转化植株叶片的潮霉素抗性鉴定
• 3 转基因植株后代T1的表型分析
• 1代转基因植株的PCR检测'>3.1 T₁代转基因植株的PCR检测
• 1代转基因植株抽穗期调查'>3.2 T₁代转基因植株抽穗期调查
• 第四章 讨论
• 1 OsELF3基因RNAI表达载体的构建
• 2 拟南芥生物节律钟基因ELF3与水稻基因OsELF3
• 3 农杆菌介导水稻愈伤组织转化体系的优化
• 参考文献
• 致谢
• 附录1:一般培养基配方
• 附录2:AAM培养基配方