SARS冠状病毒PU5基因的表达和抗血清的制备及N、M、E基因重组杆状病毒的筛选

论文摘要

经反转录聚合酶链式反应（Revers-Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）扩增了SARS 冠状病毒（SARS-CoV）BJ01 株的未知特性基因5（putative uncharacterized gene 5,PU5）的cDNA,将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1 中,测序正确后命名为pGEX-PU5,将阳性质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG 诱导表达,经SDS-PAGE和用抗GST-tag 单克隆抗体做的Western blot 分析结果显示,在该表达系统中表达了PU5基因,薄层扫描结果表明表达量为36.5%左右。用Glutathione SwpharoseTM 4B 亲和层析柱纯化表达产物,纯化的融合蛋白命名为GST-PUP5。然后用PreScissionTM 蛋白酶对融合蛋白GST-PUP5 进行解离,获得未知蛋白5（the putative uncharacterized protein 5,PUP5）,命名为PUP5。用SARS-CoV 卵黄抗体IgY 对GST-PUP5 和PUP5 进行Western blot 鉴定,证明这些蛋白具有免疫学活性。将纯化蛋白GST-PUP5 和PUP5 用弗氏完全佐剂乳化后,分两组免疫BALB/C 小鼠,即GST-PUP5 组和PUP5 组,第二三次免疫直接用切胶回收的产物接种。第一、二次免疫两周后断尾采血,第三次免疫两周后摘除眼球采血,三次采血均制备抗血清,并用ELISA 方法检测抗血清效价结果。本研究应用原核表达系统表达了PUP5 蛋白,可用于进一步解析该蛋白功能,抗血清的获得,为制备抗PUP5 的抗体和SARS 冠状病毒的鉴别诊断试剂奠定了基础。经RT-PCR 扩增了SARS-CoV BJ01 株N、M、E 基因的cDNA,将其分别克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis 2A中,重组转移载体分别命名为pBlueN、pBlueM、pBlueE,然后将其与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-BlueTM DNA）共转染Sf9 昆虫细胞,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rpBlueN、rpBlueM、rpBlueE。为在昆虫细胞中表达N、M、E 蛋白,研究其功能及制备SARS 冠状病毒亚单位疫苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 文献综述
• SARS 冠状病毒的生物学研究进展
• 引言
• 1 SARS 冠状病毒的确认
• 2 SARS 冠状病毒的分类学地位及生物学特性
• 3 SARS 冠状病毒基因组学及遗传进化规律
• 4 SARS 冠状病毒基因组编码蛋白及其功能
• 研究报告
• 实验一 SARS 冠状病毒PUP5 蛋白的表达、纯化、鉴定及抗血清的制备
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二表达 SARS 冠状病毒 N、M、E 基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 致谢
• 作者简介