玉米叶片中ABA诱导的p46MAPK的分离纯化、质谱鉴定及相关特性的研究

论文摘要

脱落酸（abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素,在植物生长、发育以及对环境的适应中起着重要的信号分子作用。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK）是真核细胞中普遍存在的信号组分,由逆境胁迫、细胞因子、植物激素、生长因子等诱导,并在植物信号中发挥重要的作用。已知许多蛋白激酶参与了ABA信号途径,MAPK也能够作为ABA信号的下游组分,发挥调节作用。因此,鉴定ABA信号途径中相关的MAPK,对于揭示ABA信号的细胞和分子机理具有重要意义。本实验室在研究ABA和H2O2活化玉米（Zea mays）叶片的MAPK时,已经发现了一种分子量为46 kDa的MAPK（p46MAPK）参与ABA诱导的抗氧化防护,但是我们不知道它是一个什么类型的MAPK,与其它植物MAPK的同源性怎么样。澄清它的性质对于进一步的分子生物学研究至关重要。因此,我们首先对p46MAPK进行分离纯化,其次进行质谱分析并确定类型,最后进行相关特性研究。结果如下：1.p46MAPK纯化：髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）是MAPK的最适底物。我们以MBP为底物,采用溶液激酶分析和凝胶激酶分析（in-gel kinase assay）相结合的方法对纯化过程中的目的蛋白进行跟踪鉴定,并在4℃条件下完成所有纯化步骤。叶片提取上清液先经30%饱和度硫酸铵沉淀,100,000g超速离心,上清经80 mlHiPrep 26/10 （Sephdex G-25F）脱盐柱脱盐后,依次进行40 ml Q sepharose FF阴离子柱、15 ml Pheny sepharose FF疏水柱、6 ml Resource Q阴离子柱、1 ml Mono Q阴离子柱、3.5 ml poly-L-lysine-agarose亲和柱和120 ml Hiload 16/60Superdex 75pg凝胶过滤柱和超滤管浓缩.经过上述步骤,最终经SDS-PAGE电泳,银染检测45 kDa maker处有单一条带,凝胶激酶实验显示能够磷酸化MBP底物。对照与ABA处理的样品同时经Mono Q纯化,进一步证明部分纯化的蛋白为ABA诱导的p46MAPK。部分纯化蛋白的纯化倍数大于10000,回收率为1.1%,激酶活性为20,420pmol min-1mg-1。2. p46MAPK鉴定：质谱已成为鉴定蛋白质的最重要技术平台之一。将目的蛋白胶切下,送北京军事医学科学院国家生物医学分析中心进行基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-TOF-MS）鉴定。利用BioTools3.0分析软件在http: //www.matrixscience. com的NCBI绿色植物数据库中进行分析。结果显示,p46MAPK与玉米中已知序列的ZmMPK5 （gi|4239889）序列覆盖达32%,匹配得分207,匹配显著（得分大于69为显著,P<0.05）。选取肽段（m/z 1779.841）进行MS/MS鉴定,序列为TTSETDFMTEYWTR,对应于ZmMPK5的218-232处肽段。为进一步证明该结果,ZmMPK5的多克隆抗体被制备。免疫共沉淀凝胶激酶的结果显示ZmMPK5为ABA诱导的p46MAPK。因此,p46MAPK即为ZmMPK5。3.ZmMPK5生物信息学分析：利用生物信息学分析ZmMPK5的分子量、等电点、细胞定位等。利用NCBI中BLAST软件,与植物中其他MAPK进行了比对,并构建了基因进化树。结果发现,ZmMPK5分子量为44.9,等电点为5.39,在线软件程序SubLoc v1.0 （http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）将其定位在细胞核中,属于MAPK家族的A族,与小麦TaMAPK、水稻OsSIPK和OsMPK6亲缘关系最近,与苜蓿MMK1、拟南AtMPK6、欧芹PcMPK6、番茄LeMPK2、马铃薯StMPK1和烟草SIPK亲缘关系其次,而与玉米中已知的其他MAPK蛋白亲缘关系相对较远。4.ZmMPK5相关特性分析：ZmMPK5的凝胶层析分子量为45.74 kDa。在温度（20-50℃）、MgCl2浓度（2.5-15 mM）和pH（5.0-9.0）情况下,该激酶都具有活性。理想反应条件为30℃、pH 8.0和10mMMgCl2.MBP和ATP的Km值分别为0.13μgμL-1和23μM。与histone和casein相比,MBP是ZmMPK5的首选底物。将磷酸化的MBP水解进行薄层层析,其磷酸化位点发生在苏氨酸上,而丝氨酸和酪氨酸未见磷酸化.在ZmMPK5:YFP表达的玉米叶片原生质体中,ZmMPK5存在于细胞质和细胞核中,主要定位在细胞核中。不同的环境胁迫因子如低温、干旱、NaCl、CdCl2、伤害、UV和激素（SA, ETH）均能够诱导ZmMPK5转录和ZmMPK5激酶活性,而ZmMPK5蛋白水平上未见明显的变化。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 摘要
• Abstract
• 1 ABA
• 1.1 ABA产生
• 1.2 ABA受体
• 1.3 ABA信号转导
• 1.4 ABA诱导基因表达
• 1.5 ABA信号网路
• 2 MAPK
• 2.1 MAPK级联系统
• 2.2 植物MAPK分类
• 2.3 完整的MAPK级联途径
• 3 ABA信号途径中的MAPK
• 3.1 MAPK参与ABA诱导的气孔关闭
• 3.2 MAPK参与ABA诱导的基因表达
• 3.3 MAPK磷酸酶参与ABA信号
• 4 总结与展望
• 5 本文研究的目的及意义
• 第二章 ABA诱导的p46MAPK的分离纯化
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 纯化步骤
• 1.4 溶液激酶活性测定
• 1.5 凝胶激酶活性分析（in-gel kinase assay）
• 1.6 凝胶电泳及染色
• 2 结果与分析
• 2.1 材料准备
• 2.2 硫酸铵分级沉淀
• 2.3 柱层析色谱分析
• 2.4 层析馏分的电泳及激酶分析
• 2.5 Mono QTM 5/50 GL层析分析ABA诱导的MAPK
• 3 讨论
• 第三章 p46MAPK的质谱鉴定及生物信息学分析
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 样品电泳
• 1.2 质谱鉴定
• 1.3 生物信息学分析
• 1.4 序列比对和进化树构建
• 2 结果与分析
• 2.1 质谱鉴定及数据库搜索
• 2.2 ZmMPK5生物学信息分析
• 2.3 串联质谱鉴定m/z 1779.841
• 2.4 进化树分析
• 2.5 细胞定位
• 3 讨论
• 第四章 ZmMPK5相关特性研究
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 材料及处理
• 1.2 ZmMPK5相关理化性质
• 1.3 薄层层析鉴定MBP底物氨基酸磷酸化
• 1.4 抗体制备
• 1.5 免疫共沉淀凝胶激酶分析
• 1.6 RT-PCR分析ZmMPK5转录变化
• 1.7 亚细胞定位
• 2 结果与分析
• 2.1 分子筛测定p46MAPK分子量
• 2.2 底物浓度及专一性与ZmMPK5活性关系
• 2.3 不同离子浓度、pH值和温度对ZmMPK5活性的影响
• 2.4 MBP氨基酸磷酸化位点
• 2.5 ZmMPK5器官特异性
• 2.6 各种胁迫因子对ZmMPK5的调控
• 2.7 ZmMPK5的亚细胞定位
• 3 讨论
• 第五章 全文结论
• 1 研究小结
• 2 创新之处
• 3 存在问题与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表与投送的学术论文