论文摘要
在本实验室先前的工作中已经证实,钝顶节旋藻（Arthrospira platensis FACHB341）藻蓝蛋白操纵子上游的419bp中有6条启动子序列,本文研究了该上游序列各启动子中与启动强度有关的因素。我们选择6条启动子中表达水平较高的3条启动子promoter 3、promoter 4和promoter 6,对其中3号启动子的-10元件和-35元件、4号启动子的-10元件及6号启动子的-35元件进行不同位点多种形式的诱变处理,流式细胞仪分析GFP的表达水平检测启动子强度。通过-35元件与-10元件中单碱基的改变对报告基因的表达的影响,分析不同碱基在启动子中所起作用的主次和强弱。TaKaRa MutanBEST Kit用来进行定点突变,结果表明,3号启动子的-10元件突变后,各突变株GFP表达量明显上升,达原表达量的2-4倍;3号启动子的-35元件突变后,GFP表达量均下降,减少到原表达量的2-4 %;而4号启动子的-10元件与6号启动子的-35元件突变后,不同突变株的表达量有上升也有下降。实验证明了-35区与-10区在保持启动子功能方面的重要作用,对阐明藻蓝蛋白基因启动子的作用机理提供了实验数据,并为蓝藻基因工程提供了强有力的启动元件。启动子是基因表达调控中重要的顺式元件,其结构与功能的研究成为分子生物学的研究热点之一。但目前的启动子研究还存在许多问题,很多启动子上的序列功能我们到现在为止还不完全清楚,特别是国内外有关藻类启动子方面的研究很少,尚未见到有关藻类启动子研究进展的综述性报道。如果能了解其研究现状,找出不足,指导未来启动子研究的方向,将会对基因表达调控的研究起到促进作用。基于此目的,我们整理了一篇综述文章,介绍了植物基因启动子的研究方法与概况,重点综述了藻类基因启动子的研究现状,介绍了本实验室对节旋藻藻蓝蛋白基因启动子的研究情况,并就启动子在基因工程中应用价值进行了讨论。另外,先前工作证明,将节旋藻FACHB341品系于25℃,光照强度40μmol.m-2.s-1条件下培养,进行转录分析,结果只有一条启动子,即1号启动子参加了转录调控。另外,通过以大肠杆菌DH5α和聚球藻（Synechococcus sp. PCC 7942）为表达载体分别证明了温度、光强的变化会影响启动子驱动的GFP报告基因的表达。为了进一步分析其作用机制,我们在极端温度、光强条件下培养节旋藻,采用SmartRace技术进行转录分析,看特定的条件下该基因的转录特征是否变化。结果证明在温度分别为15℃、35℃,光强分别为10μmol.m-2.s-1、70μmol.m-2.s-1时,藻蓝蛋白cpcB基因的转录起始位点数量、位置不变,仍只有1号启动子参加转录调控,转录起始位点位于翻译起始位点上游-285bp处。初步分析在极端温度和光强条件下培养节旋藻,不会引起cpcB基因转录起始位点的变化。至于温度、光强对启动子功能的影响机制还有待进一步研究。