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叶绿体内膜蛋白转运子的进化与核基因编码的叶绿体基因DPC1的克隆及其参与氧化胁迫功能的研究

2020-12-07阅读(222)

叶绿体内膜蛋白转运子的进化与核基因编码的叶绿体基因DPC1的克隆及其参与氧化胁迫功能的研究

论文摘要

核基因编码的叶绿体蛋白在细胞质中的核糖体上合成后必须转运到叶绿体内合适的区间以执行特定的功能。蛋白质跨叶绿体外膜与内膜的转运分别通过蛋白转运子TOC与TIC来执行。TOC复合体的各亚基在叶绿体内共生过程中的起源是由宿主细胞与内共生的蓝藻共同提供的。TOC复合体的孔道蛋白Toc75起源于蓝藻,然后TOC复合体的其他成分以Toc75为骨架整合到复合体中共同组成完整的功能性蛋白转运子。对于TIC复合体的起源,尽管复合体的一些成分通过序列比在蓝藻中发现一些序列相似的蛋白序列而假定与TOC复合体具有相似的起源模式,但是因为孔道蛋白的起源的尚未确定,TIC复合体的起源进化模式仍然是一个悬而未决的问题。本论文的第一部分通过对一个新近鉴定的TIC复合体的孔道蛋白AtTic21以及其在蓝藻中的同源蛋白的研究来解释TIC复合体的进化模式。通过系统进化分析、蛋白质二级结构、蛋白质亚细胞定位与功能上的保守性,阐明了TIC复合体与TOC复合体具有相似的进化模式。叶绿体的正常发育是维持高效的光合作用能力的前提条件。通过筛选拟南芥T-DNA插入突变体库,我们分离到一个真叶黄化的突变体damaged photosyntheticcapacity 1（dpc1）。叶绿素a与b的测定表明两种色素的含量均有降低,叶绿素a与叶绿素b的比值升高,叶绿素荧光分析表明光系统PSI与光系统PSII的光合能力均有降低的突变体。通过遗传连锁分析,证明dpc1的突变表型是单基因隐性核基因编码的基因突变导致的。通过TAIL-PCR技术克隆了DPC1基因。插入位点与表型的连锁分析与遗传互补实验表明是由于DPC1这个基因的敲除导致dpc1的黄化表型。DPC1编码一个PPR家族的蛋白,在其氨基酸序列的羧基段同时含有一个SMR结构域。基因表达分析表明DPC1在植物各主要器官根茎叶花中均有表达,在拟南芥幼苗中也有表达。暗培养的黄化幼苗中也有表达。用反映组织内过氧化氢与超氧阴离子含量的特异性染色实验表明咖dpc1中有较高水平的积累。光下与黑暗中的过氧化氢漂白实验表明dpc1突变体中存在较严重的光氧化胁迫。结果表明DPC1基因对于植物叶绿体维持正常的色素水平,正常的光合作用能力以及正常的氧化胁迫耐受是必需的。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 文献综述
  • 第一部分:叶绿体蛋白转运子的进化起源
  • 1.前言
  • 2.
  • 2.1 TOC复合体
  • 2.1.1 TOC复合体结合前体蛋白的受体成分
  • 2.1.2 TOC复合体的孔道蛋白与蛋白的转运
  • 2.2 TIC复合体
  • 2.3 前体蛋白在基质中成熟
  • 3 拟南芥中同源基因的研究情况
  • 4 TOC与TIC的进化研究
  • 第二部分:PPR家族蛋白与光氧化胁迫
  • 1.PPR家族蛋白简介与其在叶绿体发育中的作用
  • 2.光氧化化胁迫
  • 材料与方法
  • 1、材料
  • 1.1 植物材料、质粒、菌株
  • 1.2 工具酶和试剂
  • 1.3 抗生素与除草剂
  • 1.4 主要仪器
  • 1.5 所用到的数据库与在线分析软件
  • 2.实验方法
  • 2.1 植物培养
  • 2.2 植物组织DNA的提取
  • 2.3 PCR
  • 2.4 热击感受态E.coli制备
  • 2.5 大肠杆菌的转化
  • 2.6 农杆菌感受态细胞的制备
  • 2.7 农杆菌的转化
  • 2.8 克隆载体的鉴定
  • 2.9 拟南芥转化
  • 2.10 质粒DNA的少量制备 碱裂解法
  • 2.11 质粒DNA的大量制备
  • 2.12 连接体系的建立
  • 2.13 RNA抽提及反转录
  • 2.14 树脂切片法
  • 2.15 透射电镜材料制作
  • 2.16 叶绿素含量的测定
  • 2.17 DAB染色与NBT染色
  • 2.18 过氧化氢漂白实验
  • 2.19 Norflurazon处理实验
  • 2.20 拟南芥杂交
  • 2.21 GUS组织化学染色
  • 结果与讨论
  • 第一部分
  • 概述
  • 结果
  • AtTic21的同源蛋白存在于光合生物中
  • SynTic21是AtTic21的结构同源蛋白
  • AtTic21基因敲除突变体的获得
  • SynTic21是AtTic2l的功能同源蛋白
  • 讨论
  • AtTic21在进化起源上相比其他的膜转运蛋白成分更为保守
  • SynTic21在蓝藻中的同源蛋白可能执行与光合作用相关的功能
  • SynTic21蛋白缺少转运肽
  • 遗传互补的策略可以用于阐明其他蛋白在进化上的起源
  • 第二部分
  • 概述
  • 结果
  • 突变体dpc1的分离与表型分析
  • 突变体dpc1的光合能力与叶绿体结构观察
  • 基因DPC1的克隆
  • DPC1编码一个PPR家族的叶绿体定位蛋白
  • DPC1的表达模式
  • 叶绿体编码基因的表达与转录后RNA的编辑
  • DPC1对于植物维持拟南芥的光氧化耐受是必需的
  • 质体向细胞核的逆向信号传导过程在dpc1中没有受到影响
  • 讨论
  • dpc1的表型
  • DPC1编码一个羧基端含有SMR结构域的PPR家族的叶绿体蛋白
  • DPC1的功能
  • 参考文献
  • 附录
  • 引物表
  • 载体图
  • 发表论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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