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多环芳烃类环境激素的实时定量免疫PCR检测方法研究

2020-12-05阅读(410)

多环芳烃类环境激素的实时定量免疫PCR检测方法研究

论文摘要

多环芳烃（PAHs）是指含有2个或2个以上苯环的碳氢化合物的统称。煤、石油、天然气、有机高分子化合物和许多碳氢化合物等在不完全燃烧后都能生成PAHs。诸如,取暖、化石燃料燃烧、公路交通、餐饮业,甚至是吸烟等人类活动都是PAHs的污染源。多环芳烃类物质数量多,分布广,对人类危害极大,有多种PAHs已被鉴定出具有致癌性,这使得近年来对于PAHs的检测研究成为一个新的热点。美国环保局将16种PAHs列为优先控制污染物并作为环境监测必检项目,本论文研究的四种PAHs均在此列。因此,非常有必要对上述的PAHs建立灵敏可靠的分析方法。目前,检测PAHs最常见的方法是气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）。但是这些方法复杂且耗时的前处理过程使得它们不适合于现场快速检测。而免疫PCR（IPCR）技术由于其特异性和灵敏性而无需复杂的前处理过程,因此是一种非常适用于现场快速检测的分析方法。免疫PCR是1992年由Sano首次提出的,它将体系完善的ELISA分析方法和具有强大信号放大能力的PCR体系结合起来。大量的应用研究表明,该方法与ELISA相比不仅具有很好的一致性而且灵敏度更高,线性范围更广,具有更强的检测能力。免疫PCR方法建立以来,已经在癌症、自身免疫缺陷、致病菌和细菌毒性等方向得到广泛应用,但是还没有应用在环境小分子污染物检测方面的报道。免疫PCR在技术和信号检测仪器上的进一步发展导致了实时定量免疫PCR技术（RT-IPCR）的产生。实时定量免疫PCR方法尽管建立的时间不长,但是随着它应用的推广,已经证明该方法比一般的免疫PCR具有更高的精确度,与一般免疫PCR的15-20%的实验室内部误差相比,该技术的内部误差降到了5-10%。至今,只有少量PAHs的有制备单克隆或多克隆抗体的文献报道,而本论文研究的四种PAHs的抗体制备均未见报道,更未见有文献报道应用实时定量免疫PCR分析方法来检测环境中PAHs。本论文建立了三种RT-IPCR分析方法来检测环境中痕量的PAHg。本课题主要研究内容及结论如下:（1）免疫原的制备:PAHs是小分子物质,不能直接免疫动物产生抗体,必需偶联大分子载体;且结构上不具备可与载体偶联的基团,因此本论文先通过Friedel-Crafts酰基化反应在蒽、菲和荧蒽分子上引入羧基,得到PAHs-丁酸-γ-氧作为半抗原应用于接下来的实验。萘则直接购买萘氧乙酸作为半抗原。接着用活化酯法分别将这些半抗原与牛血清蛋白（BSA）偶联,制得PAHs的免疫原;用混合酸酐法将半抗原分别与卵清蛋白（OVA）偶联,制得PAHs的包被原。产物的结构和组成经过红外光谱、紫外光谱、质谱和核磁共振鉴定分析。（2）抗体的制备:将免疫原与适当的佐剂乳化后,免疫新西兰大白兔。初次免疫后进行加强免疫,在第三次加强免疫之后,以试管凝集试验和琼脂双向免疫扩散实验测定从兔耳缘采的的抗血清的效价。试管凝集试验中出现了凝集反应,琼脂双向免疫扩散试验中也出现了明显的沉淀线。将兔子体内获得的抗血清用辛酸-硫酸铵二步沉淀法、葡聚糖凝胶除盐及DEAE-纤维素精制提纯,得到纯化的四种PAHs多克隆抗体IgG。琼脂双向扩散实验表明萘、蒽、菲和荧蒽的抗体效价分别为:1∶32,1∶32,1∶64,1∶32。（3）生物素化探针DNA的制备和纯化:探针DNA是以pUC19质粒为模板扩增得到的一段103个碱基对的生物素化DNA。根据DNA扩增试剂盒的说明,在PCR扩增体系中加入各种反应物,包括两条生物素化了的引物。引物序列分别是:上游引物序列从5’到3’是G TAA AAC GAC GGC CAG T,下游引物的序列从5’到3’是CAG GAA ACA GCT ATG AC。PCR扩增的程序是:94℃预变性4 min。然后是30个循环反应,每个循环的程序是94℃变性20s,55℃退火20s,72℃延伸20s。最后再72℃保持3 min使延伸完全。使用UNIQ-10 PCR纯化试剂盒,对PCR扩增产物进行纯化后,再用琼脂糖凝胶电泳后染色进行定性,并用紫外分光光度法定量检测分析。（4）生物素化抗体的制备:按照文献报道的方法,将自制的四种PAHs的特异性抗体与活化的生物素（BNHS）进行结合反应,产物经过柱纯化后,得到四种PAHs的特异性生物素化抗体。（5）生物素化半抗原的制备:按照文献报道的方法,将自制的四种PAHs半抗原与活化生物素（BNHS）进行合成反应后,产物经过柱纯化即得到四种PAHs的生物素化半抗原。（6）直接竞争RT-IPCR:本论文首次建立了直接竞争实时定量免疫聚合酶链式反应（直接竞争RT-IPCR）分析方法,用于检测环境中四种PAHs。用制备的包被原包被经过戊二醛处理的PCR小管,然后用PAHs与包被原竞争结合生物素化抗体,再利用亲和素连接生物素化抗体和生物素化的103bp探针DNA,最后通过实时定量PCR仪,在优化的扩增程序下扩增DNA并实时检测。论文建立了直接竞争RT-IPCR分析方法的标准直线,考察了方法的特异性、回收率、检测限并应用于实际环境样品的检测,结果令人满意。（7）间接竞争RT-IPCR:本论文首次建立了间接竞争实时定量免疫聚合酶链式反应（间接竞争RT-IPCR）分析方法,用于检测环境中四种PAHs。用制备的包被原包被经过戊二醛处理的PCR小管,接着用PAHs与包被原竞争结合特异性抗体,再利用生物素化二抗与结合在包被原上的特异性抗体结合,然后通过亲和素与制备的生物素化的103bp探针DNA结合,最后通过实时定量PCR仪在优化的扩增程序下扩增DNA并实时检测。论文建立了间接竞争RT-IPCR分析方法的标准直线,考察了方法的特异性、回收率、检测限并应用于实际环境样品的检测,结果令人满意。（8）抗体包被RT-IPCR:本论文首次建立了抗体包被实时定量免疫聚合酶链式反应（抗体包被RT-IPCR）分析方法,用于检测环境中四种PAHs。用制备的特异性抗体包被经过戊二醛处理的PCR小管,然后用生物素化半抗原和PAHs竞争与包被抗体结合,再利用亲和素连接生物素化半抗原和生物素化的103bp探针DNA,最后通过实时定量PCR仪在优化的扩增程序下扩增DNA并实时检测。论文建立了抗体包被RT-IPCR分析方法的标准直线,考察了方法的特异性、回收率、检测限并应用于实际环境样品的检测,结果令人满意。（9）高效液相色谱法的优化及与四种方法的比较:在参考国家标准方法高效液相色谱法（HPLC）的基础上,为本论文的研究对象——四种PAHs专门优化了它们的HPLC分离条件。论文建立了该方法的标准直线,考察了方法的检测限并应用于实际环境样品的检测,结果令人满意。并将该方法的各项指标与本论文首次建立的三种RT-IPCR分析方法进行比较,就其优缺点进行了讨论。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  • 1.1 课题的研究背景
  • 1.1.1 聚合酶链式反应（PCR）技术概述
  • 1.1.2 免疫分析技术概述
  • 1.1.3 免疫PCR分析技术概述
  • 1.1.4 实时定量IPCR分析技术概述
  • 1.2 课题的研究对象
  • 1.2.1 多环芳烃概念
  • 1.2.2 多环芳烃的危害
  • 1.2.3 多环芳烃的来源
  • 1.2.4 多环芳烃的监测控制
  • 1.3 课题的研究目的和意义
  • 1.4 课题的研究内容和技术路线
  • 1.4.1 研究内容
  • 1.4.2 技术路线
  • 1.4.3 本课题的特色和创新之处
  • 1.5 小结
  • 第二章 四种多环芳烃人工抗原的合成
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验仪器、材料和试剂
  • 2.2.1 实验仪器
  • 2.2.2 实验材料和试剂
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 三种多环芳烃半抗原的合成和表征
  • 2.3.2 四种多环芳烃人工抗原的合成
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.4.1 四种多环芳烃半抗原的表征
  • 2.4.2 四种多环芳烃人工抗原的鉴定
  • 2.5 本章小结
  • 第三章 四种多环芳烃多克隆抗体的制备
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验仪器、材料和试剂
  • 3.2.1 实验仪器
  • 3.2.2 实验材料和试剂
  • 3.3 试验方法
  • 3.3.1 免疫动物的选择
  • 3.3.2 佐剂的制备
  • 3.3.3 免疫方案的确定
  • 3.3.4 抗血清的收集与分离
  • 3.3.5 四种多环芳烃多克隆抗体的纯化
  • 3.3.6 抗血清的保存
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 四种多环芳烃多克隆抗体含量的测定
  • 3.4.2 四种多环芳烃多克隆抗体效价的测定
  • 3.5 本章小结
  • 第四章 RT-IPCR分析方法建立的前期准备
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验仪器、材料和试剂
  • 4.2.1 实验仪器
  • 4.2.2 实验材料和试剂
  • 4.3 试验方法
  • 4.3.1 生物素的活化
  • 4.3.2 四种多环芳烃生物素化半抗原的合成和鉴定
  • 4.3.3 四种多环芳烃生物素化抗体的合成和鉴定
  • 4.3.4 生物素化DNA的合成
  • 4.3.5 PCR管的戊二醛预处理
  • 4.4 结果与讨论
  • 4.4.1 四种多环芳烃生物素化抗体的紫外鉴定
  • 4.4.2 偶联物浓度的测定
  • 4.4.3 生物素化DNA的鉴定
  • 4.4.4 戊二醛处理的最佳条件
  • 4.5 本章小结
  • 第五章 直接竞争RT-IPCR分析方法测定四种PAHS
  • 5.1 引言
  • 5.1.1 实时定量免疫聚合酶链式反应
  • 5.1.2 直接竞争RT-IPCR一般步骤
  • 5.1.3 直接竞争RT-IPCR实验原理
  • 5.2 实验仪器、材料和试剂
  • 5.2.1 实验仪器
  • 5.2.2 实验材料和试剂
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 直接竞争RT-IPCR分析方法的条件优化
  • 5.3.2 直接竞争RT-IPCR分析方法标准曲线的建立
  • 5.3.3 直接竞争RT-IPCR分析方法特异性评价
  • 5.3.4 直接竞争RT-IPCR分析方法实际环境样品的测定和加标回收率
  • 5.4 结果与讨论
  • 5.4.1 实验条件的优化
  • 5.4.2 四种PAHs的直接竞争RT-IPCR分析方法标准曲线及实际样品的测定
  • 5.5 本章小结
  • 第六章 间接竞争RT-IPCR分析方法测定四种PAHS
  • 6.1 引言
  • 6.1.1 间接竞争RT-IPCR的一般步骤
  • 6.1.2 间接竞争RT-IPCR分析方法原理
  • 6.2 实验仪器、材料和试剂
  • 6.2.1 实验仪器
  • 6.2.2 实验材料和试剂
  • 6.3 实验方法
  • 6.3.1 间接竞争RT-IPCR分析方法的条件优化
  • 6.3.2 间接竞争RT-IPCR分析方法标准曲线的建立
  • 6.3.3 间接竞争RT-IPCR分析方法特异性评价
  • 6.3.4 间接竞争RT-IPCR分析方法实际环境样品的测定和加标回收率
  • 6.4 结果与讨论
  • 6.4.1 实验条件的优化
  • 6.4.2 四种PAHs的间接竞争RT-IPCR分析方法标准曲线及实际样品的测定
  • 6.5 本章小结
  • 第七章 抗体包被RT-IPCR分析方法测定四种PAHS
  • 7.1 引言
  • 7.1.1 抗体包被RT-IPCR一般步骤
  • 7.1.2 抗体包被RT-IPCR分析方法原理
  • 7.2 实验仪器、材料和试剂
  • 7.2.1 实验仪器
  • 7.2.2 实验材料和试剂
  • 7.3 实验方法
  • 7.3.1 抗体包被RT-IPCR分析方法的条件优化
  • 7.3.2 抗体包被RT-IPCR分析方法标准曲线的建立
  • 7.3.3 抗体包被RT-IPCR分析方法特异性评价
  • 7.3.4 抗体包被RT-IPCR分析方法实际环境样品的测定和加标回收率
  • 7.4 结果与讨论
  • 7.4.1 实验条件的优化
  • 7.4.2 四种PAHs的抗体包被RT-IPCR分析方法标准曲线及实际样品测定
  • 7.5 本章小结
  • 第八章 HPLC分析方法测定四种PAHS
  • 8.1 前言
  • 8.2 实验仪器、材料和试剂
  • 8.2.1 实验仪器
  • 8.2.2 实验材料和试剂
  • 8.3 实验方法
  • 8.3.1 HPLC实验条件优化
  • 8.3.2 标准曲线的绘制
  • 8.3.3 实际环境样品的测定
  • 8.4 结果与讨论
  • 8.4.1 实验条件的优化
  • 8.4.2 四种多环芳轻的HPLC标准曲线
  • 8.4.3 实际土壤样品的HPLC检测
  • 8.5 本章小结
  • 第九章 结论与展望
  • 9.1 结论
  • 9.2 展望
  • 参考文献
  • 攻读博士学位期间申请专利以及已发表和待发表的文章
  • 致谢

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