NDRG2在唾液腺组织中的表达和功能研究

论文摘要

人NDRG2（N-myc down-stream regulated gene 2）基因为本研究小组首先发现并报道,该基因可能与细胞增殖和分化相关,但其具体的生物学功能有待进一步研究。我们课题组前期研究的结果对本课题的深入研究有重要的提示作用:RNA点杂交实验表明NDRG2在人的唾液腺组织中表达量极高;免疫组化结果显示NDRG2在小鼠的舌下腺导管上皮细胞特异性高表达;酵母双杂交实验寻找能与NDRG2相互作用的分子,最终筛选到12个有正确读框的的克隆,其中有3个克隆是Na+/K+-ATPaseβ1的肽段;生物信息学预测,在NDRG2上游调控区存在潜在的雌激素受体（ER）结合位点。唾液腺导管细胞的重要生物学功能是重吸收唾液中的Na+和Cl-等电解质,从而参与调节唾液（正常唾液渗透压为血浆渗透压的1/9）的生成,而唾液进入导管后Na+的重吸收依赖导管细胞腔侧分布的上皮细胞钠通道（epithelial sodium channel, ENaC）。有文献报道非洲蟾蜍卵母细胞中,NDRG2可以激活ENaC。Na+/K+-ATPaseβ1是Na+/K+-ATPase（又称为钠钾泵）的亚基,是Na+/K+-ATPase发挥泵功能不可缺少的组成成分。存在于唾液腺导管细胞基底侧的Na+/K+-ATPase,以主动耗能的方式将细胞中的Na+泵到细胞外,形成一定的细胞内外Na+浓度阶差,进而影响唾液腺导管细胞腔侧ENaC对从腺泡分泌进入导管的原始唾液中Na+的重吸收。临床口腔干燥症的好发人群为绝经后女性,50%以上的绝经后女性有自觉口干症状,口干病人的唾液电解质成分与正常人差异很大,唾液渗透压和电解质浓度往往明显增高、唾液粘稠。先前的研究结果强烈提示NDRG2在唾液腺组织中发挥重要的功能,特别是与唾液的生成可能高度相关,本课题将对此进行探讨和验证。【目的】1、明确NDRG2在唾液腺组织中的分布和定位;2、研究NDRG2在唾液腺细胞中的功能与Na+/K+-ATPaseβ1的关联性;3、探讨NDRG2在人唾液腺细胞中是否受到雌激素的调控;4、整体水平分析雌激素与唾液形成之间的关系以及NDRG2在其中可能发挥的功能。【方法】1、通过免疫组织化学和间接免疫荧光的方法明确NDRG2在唾液腺组织的分布与定位,RT-PCR分析正常人颌下腺NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4的表达情况。2、建立单层唾液腺导管细胞离子转运模型,检测NDRG2对各种离子和水分子转运的影响;运用哺乳动物双杂交和免疫共沉淀实验验证NDRG2与Na+/K+-ATPaseβ1的相互作用;间接免疫荧光观察NDRG2与Na+/K+-ATPaseβ1在细胞内是否存在共定位;分析NDRG2对Na+/K+-ATPase酶活性的影响;Real time PCR和Western Blot检测NDRG2对Na+/K+-ATPaseβ1表达的影响。3、Real time PCR和Western Blot分析17-β-雌二醇（E2）对NDRG2表达水平的影响;运用双报告基因、ChIP和EMSA等基因转录调控实验明确NDRG2是否受E2-ER转录复合物的调控。4、建立去势雌性大鼠模型（去卵巢手术）模拟绝经后女性体内雌激素水平,检测大鼠唾液流量、唾液电解质成分及颌下腺NDRG2、Na+/K+-ATPase和ENaC表达水平的变化。【结果】1、NDRG2蛋白在唾液腺导管细胞胞浆中特异性高表达NDRG2蛋白主要表达于人三对大唾液腺（腮腺、颌下腺和舌下腺）以及大鼠的颌下腺的导管细胞胞浆,而腺泡细胞中表达很弱。RT-PCR结果表明正常人颌下腺组织NDRG2 mRNA表达相对高,NDRG1和NDRG3的表达相对较低,而NDRG4几乎不表达、2、NDRG2可以结合并稳定Na+/K+-ATPaseβ1蛋白在单层唾液腺导管细胞离子转运模型中,感染NDRG2腺病毒或转染针对NDRG2的干涉片段,特异性过表达或沉默NDRG2,结果唾液腺导管细胞基底侧与腔侧Na+和Cl-浓度比值明显与NDRG2表达量成正比,而细胞基底侧与腔侧K+和Ca2+浓度比值没有明显的变化,基底侧和腔侧的液体体积均未出现显著改变。哺乳动物双杂交和免疫共沉淀结果进一步证实NDRG2和Na+/K+-ATPaseβ1可以相互作用。间接免疫荧光结果显示NDRG2和Na+/K+-ATPaseβ1在人永生化唾液腺导管细胞HSG的核周胞浆存在部分共定位。HSG细胞中相同总蛋白中Na+/K+-ATPase的活性与NDRG2的表达水平成正比,并且NDRG2可以稳定Na+/K+-ATPaseβ1蛋白,延长Na+/K+-ATPaseβ1蛋白的半衰期。3、NDRG2受E2-ERβ转录复合物的调控,是雌激素的靶基因E2可以时间和剂量依赖的方式上调NDRG2的表达,并且NDRG2 mRNA和蛋白水平的表达均有所增加。间接免疫荧光实验表明:ERα和ERβ均主要分布于人唾液腺组织的导管细胞中,ERβ表达强度明显高于ERα,ERβ和NDRG2均高表达于唾液腺导管细胞。ERβ可以剂量依赖的方式增加NDRG2上游调控区报告基因的活性,而ERα不能激活报告基因,ERβ的特异性激动剂DPN能够增强报告基因活性,而ERα的特异性激动剂PPT不能激活报告基因,运用ERβ配体结合区截短突变体或干涉ERβ的表达均能显著降低报告基因的活性,并且将潜在的ERE（estrogen response elements）进行点突变,报告基因的活性明显降低。ChIP和EMSA实验检测到外源性ERβ或内源性ERβ均能结合于NDRG2上游调控区预测的ERE。4、NDRG2参与去势雌性大鼠口腔干燥去卵巢大鼠手术后体内雌激素水平明显迅速下降,去势雌性大鼠逐渐出现毛发枯疏、骨质疏松等与体内雌激素水平相关的表征;有明显的口腔干燥症状,即唾液流量减少、饮水增多及唾液中Na+和Cl-浓度增高。PCR结果显示去卵巢大鼠颌下腺组织中NDRG2和ENaCβ的mRNA水平明显减少,Na+/K+-ATPaseβ1mRNA水平无明显变化;免疫组化结果表明NDRG2、Na+/K+-ATPaseβ1和ENaCβ的蛋白含量均明显降低。【结论】本课题揭示了NDRG2是受雌激素调控的下游靶基因之一,初步证实E2-ER转录复合物-NDRG2-Na+/K+-ATPaseβ1通路的存在,并且这个通路可能参与临床绝经后女性口腔干燥症。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一 NDRG2 的研究现状
• 二 唾液腺的结构功能与口腔干燥
• 三 雌激素受体（ER）
• 四 蛋白质-蛋白质相互作用的研究方法
• 正文
• 第一部分 NDRG2 在唾液腺组织中的表达分布
• 引言
• 1 实验材料和主要仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第二部分 NDRG2 在唾液腺导管细胞中的功能与Na+
• 引言
• 1 实验材料和主要仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第三部分 雌激素对NDRG2 的调控机制研究
• 引言
• 1 实验材料和主要仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第四部分 去势雌性大鼠口干模型的建立 及 NDRG2 与口腔干燥的关联性
• 引言
• 1 实验材料和主要仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢