论文摘要
目的：观察中药威灵仙对体外培养的兔膝关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原、TGF-β1 mRNA表达的影响,以探讨单味中药对软骨损伤的修复作用及可能机制。方法：无菌操作下获取新西兰白兔膝关节软骨,剪碎后,采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶顺次消化法原代分离培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代培养的软骨细胞形态变化及甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色方法鉴定；取处于对数生长期第3代细胞随机分为两组,实验组分别加入0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/ml的威灵仙培养基,对照组仅加入普通完全培养基进行培养,MTT比色法检测不同浓度的威灵仙对软骨细胞增殖的影响,免疫组织化学染色方法检测不同浓度的威灵仙对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响,RT-PCR法检测威灵仙对软骨细胞TGF-β1 mRNA表达变化的影响。结果：①原代软骨细胞呈圆球形,悬浮状态,24h后大部分细胞贴壁,外观为多角形和不规则状；约10天后,软骨细胞增殖生长融合成片,外观呈典型“铺路石”状；传代后的软骨细胞生长速度加快,传4代后逐渐出现长梭形软骨细胞,传代培养至6代时,绝大部分细胞为长梭形呈成纤维细胞样外观,生长速度明显减慢,传代周期延长。软骨细胞经甲苯胺蓝染色后细胞外基质可见蓝色异染颗粒,细胞核染成深蓝色,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色可见软骨细胞胞浆棕黄色异染颗粒。②不同浓度的威灵仙均能促进软骨细胞增殖,尤以0.5mg/ml的威灵仙对软骨细胞的增殖效果明显,且增殖高峰出现在威灵仙干预后的第3天。③威灵仙干预后的软骨细胞均能阳性表达Ⅱ型胶原,其中0.1mg/ml、0.5mg/ml威灵仙组软骨细胞Ⅱ型胶原阳性表达的面积、吸光光度值、阳性表达率均优于其他组,与对照组相比有显著性差异（P<0.05）,其中0.5mg/ml威灵仙组在软骨细胞Ⅱ型胶原阳性表达面积方面有非常显著性差异（P<0.01）。④0.05、0.1、0.5、1.0mg/ml威灵仙组均能促进软骨细胞TGF-β1 mRNA的表达,四组组间差异无显著性意义（P>0.05）,但作用的高峰为0.5mg/ml组。结论：威灵仙能够促进体外培养的兔膝关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原、TGF-β1 mRNA的表达,这可能是其修复软骨损伤的作用及可能机制之一。