胆汁中33.5kDa泡相蛋白的分离纯化

论文摘要

胆汁中的33.5kDa泡相蛋白（33.5kDa vesicular protein）是1998年由马保金等人从胆固醇结石患者胆汁中分离纯化出的。其蛋白浓度为0.46±0.06mg／ml，约占胆汁总蛋白量的0.552％。尽管33.5kDa泡蛋白含量甚微，却具有显著的促成核作用，通过测定得出成核活性强达0.310，是迄今发现活性最强的成核效应蛋白。寻找最强促成核活性蛋白，可用于研制诊断试剂盒判断和预测胆石发生、发展趋势。本实验采用了高速离心、离子交换层析、分子筛层析等方法，来寻找一条快速方便经济的分离纯化胆汁中33.5kDa泡相蛋白的方法。在此基础上可以利用纯化的33.5kDa泡相蛋白制备单克隆抗体从而利用ELISA的原理制成胶体金快速诊断试剂盒用来检测蛋白作为普查诊断的标准。实验首先采用了离子交换层析，尝试了阴离子、阳离子两种填料，经过四个pH条件的摸索得出目的蛋白应为酸性蛋白，对离子交换层析填料吸附性强，难于洗脱。之后，采用Phenyl-Sepharose Fast Flow，由于胆汁中胆红素可能疏水性更强，从而目的蛋白不能够有效的挂在填料上，而且对填料的损坏也很严重。最后通过高速离心结合分子筛层析的方法得到了电泳纯的蛋白样品，利用得到的蛋白样品进行了模拟胆汁成核的活性测定，实验结果说明分离到的蛋白有成核活性，经RP-HPLC进行纯度鉴定，目的蛋白纯度基本可以。还需进一步实验分析样品是否是我们的目的蛋白。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1.胆囊
• 1.1 胆囊的功能
• 1.2 胆汁
• 2.胆石症的概况
• 2.1 胆石症的现状
• 2.2 胆结石的分类
• 2.3 引发胆石症的因素
• 2.4 胆石症的临床表现
• 2.5 胆结石的诊断
• 2.6 胆结石病的危害性
• 3.胆石症的治疗
• 4.胆固醇结石的成因
• 5.胆汁成核效应蛋白的研究进展
• 5.1 促成核蛋白
• 5.2 抑制成核蛋白
• 6.单克隆抗体的应用
• 6.1 单克隆抗体的特点
• 6.2 单克隆抗体在医学检验上的应用
• 6.3 单克隆抗体在临床治疗上的应用
• 6.4 国内外单抗研究现状
• 7.ELISA诊断方法的原理及研究进展
• 7.1 EIA的特点与发展趋势
• 7.2 ELISA的原理
• 7.3 ELISA的应用
• 8.免疫胶体金技术的基本原理
• 9.课题意义及目的
• 第二部分 实验部分
• 1.实验材料
• 1.1 原料
• 1.2 模拟胆汁的配制原料
• 1.3 其他试剂
• 1.4 仪器与设备
• 1.5 计算机分析软件
• 2.实验主要试剂的配制
• 2.1 不同pH的不同浓度的磷酸缓冲液的配制
• 2.2 不同浓度pH3.0甘氨酸-盐酸缓冲液的配制
• 2.3 不同浓度pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液的配制
• 2.4 不同浓度pH9.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的配制
• 2.5 含150mmol/LNaCl的20mmol/L Tris-HCl的pH7.4 TBS的配制
• 2.6 10mmol/L STDC-TBS溶液的配制
• 2.7 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制
• 2.7.1 储存液的配制
• 2.7.2 工作液的配制
• 2.7.3 染色液
• 2.7.4 配制X%分离胶（总体积10ml）
• 2.7.5 配制5%浓缩胶
• 2.7.6 样品处理及上样
• 2.7.7 电泳
• 2.8 模拟胆汁的配制
• 2.8.1 所需材料
• 2.8.2 计算各物质量
• 2.8.3 材料的处理
• 2.8.4 模拟胆汁的配制
• 3.离子交换柱分离蛋白
• 4.疏水层析法分离蛋白
• 5.分子筛层析法分离蛋白
• 6.RP-HPLC的使用
• 第三部分 结果与分析
• 1.层析条件的选择
• 1.1 离子交换层析填料的选择
• 1.1.1 CM-Sephadex C-50处理pH3、pH5的样品
• 1.1.2 CM-Sephadex C-50处理pH7、pH9的样品
• 1.1.3 QAE-Sephadex A-25处理pH3、pH5的样品
• 1.1.4 QAE-Sephadex A-25处理pH7、pH9的样品
• 1.1.5 离子交换层析结果分析
• 1.2 分析调pH到3的透析后胆汁上清和沉淀
• 1.2.1 调过pH后的上清进行阳离子交换实验的结果
• 1.2.2 调pH到3后沉淀部分进行分析的结果
• 1.2.3 调pH到3后沉淀部分在缓冲液中溶解情况的分析
• 1.2.4 调pH到3后沉淀部分在TBS缓冲液中溶解情况的分析
• 1.2.5 用5mM pH3 Gly-HCl溶解调胆汁pH值到3后的沉淀进行疏水层析
• 1.2.6 用CM-Sephadex C-50处理调胆汁pH值到3产生的沉淀
• 1.3 对于胆汁中胆色素的处理
• 1.3.1 调不同oH值检查胆色素的沉淀效果
• 1.3.2 Sephadex G-25分离处理的胆汁样品
• 1.3.3 重复验证Sephadex G-25分离处理的胆汁样品结果
• 1.4 分析不同填料上样后平衡时洗出的蛋白
• 1.4.1 阳离子交换填料CM-Sephadex C-50上样后平衡时洗出的蛋白
• 1.4.2 疏水填料Phenyl Sepharose Fast Flow上样后平衡时洗出的蛋白
• 2.33.5kDa泡相蛋白的活性测定
• 2.1 第一次活性测定
• 2.2 第二次活性测定
• 2.3 第三次活性测定
• 3.模拟胆汁成核过程光镜观察结果
• 4.分子筛层析后所得纯化物HPLC纯度分析
• 4.1 梯度洗脱
• 4.2 恒浓度洗脱
• 4.2.1 60%乙腈浓度洗脱
• 4.2.2 50%乙腈浓度洗脱
• 第四部分 总结
• 参考文献
• 致谢