鸡输卵管组织特异性基因打靶载体的构建及诱导鸡免疫耐受模型的建立

论文题目: 鸡输卵管组织特异性基因打靶载体的构建及诱导鸡免疫耐受模型的建立

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 赵晨

导师: 李赞东

关键词: 转基因鸡,基因打靶,免疫耐受

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 二十多年来,用转基因动物生产药物蛋白已经取得了突破性进展,具有广阔的应用前景。与哺乳动物相比,禽类具有个体小,繁殖率高,世代间隔短,蛋中可以获得目的基因产物等优势。但是由于禽类的独特的生殖生理特点,鸡输卵管生物反应器的开发相对落后。本研究首先构建了鸡输卵管组织特异性基因打靶载体和分泌型融合表达载体,将后者转染鸡法氏囊淋巴细胞(DT40)系,筛选得到了可稳定表达并分泌人Leptin和GFP的细胞,为转基因鸡的研究和输卵管生物反应器的制备奠定了基础。同时,为了解决外源基因产物引起宿主免疫应答的问题,本文通过在鸡胚发育早期的不同阶段,采用胚胎血管微注射和卵黄注射两种方式,将外源蛋白抗原引入鸡胚,诱导了出生后小鸡对同种抗原的免疫耐受,获得了完全免疫耐受和部分免疫耐受的个体。 1.鸡输卵管组织特异性基因打靶载体和分泌型融合表达载体的构建 用PCR的方法,扩增本实验室已构建的含卵清蛋白基因5’调控序列及溶菌酶基因序列的载体pOVALG,得到1.2kb的含卵清蛋白组织特异性启动子和溶菌酶信号肽序列的DNA片段;用限制性内切酶酶切本实验室已构建的含卵清蛋白基因5’调控序列和自身信号肽编码序列的载体pOVAG-2,得到3.0kb的DNA片段,以这两条片段分别作为两种基因打靶载体的上游同源臂。下游同源臂则采用PCR的方法从鸡血液基因组中扩增得到。将上下游同源臂分别连接到质粒pEGFP-N1中GFP基因的两侧,并在同源臂外侧插入HSV-tk基因作为负筛选标记,构建得到了两种卵清蛋白基因打靶载体pOVALs-targeting和pOVA-targeting,这两种载体可将外源基因引入鸡基因组中卵清蛋白基因位点,受卵清蛋白启动子调控表达。 用PCR的方法从质粒HOB中扩增得到人肥胖基因(obese)序列,将其插入质粒pEGFP-N1的多克隆位点中使其和GFP基因融合表达,并在其上游加入了溶菌酶基因的信号肽序列,构建得到了无组织特异性分泌型融合表达载体phLepGFP-secretion。 2.分泌型融合表达载体在真核细胞中的表达 将载体phLepGFP-secretion转染原代培养的鸡胚成纤维细胞中,可以观察到明显的绿色荧光,证明融合载体构建成功。之后,将载体再次转染鸡法氏囊淋巴DT40细胞系检测到绿色荧光。加入G418药物筛选,最终得到52份细胞克隆,PCR检测结果表明,其中有44份样本可扩增出外源基因特异性片段,阳性率为84.62%(44/52)。用ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)法分析阳性细胞上清,可检测到人obese基因产物Leptin,浓度最高可达512pg/ml。 3.诱导鸡免疫耐受的初步研究 采用胚胎血管微注射的方式,将外源蛋白抗原牛乳酪蛋白(casein)、牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)分别引入不同发育时期的鸡胚中,待小鸡孵化后,按照常规免疫方法再次给小鸡接种在胚胎期注射的同种抗原,收集血清样本,并用ELISA法检测血清中的抗体水平。结果表明,在鸡胚发育到65-70小时(stage17-18)接种抗原,可以较好的诱导小鸡在出生后对同种抗原的免疫耐受,耐受率的平均水平在54%以上。而在胚胎发育到70-74小时和88-113小时阶段接种抗原,则不能诱导孵化的小鸡产生免疫耐受。 采用卵黄注射的方式,将外源蛋白BSA和HSA分别引入发育3-7天的鸡胚中,孵化后用上述方法再次接种同种抗原,并用ELISA法检测小鸡体内抗体水平。结果表明,在胚胎发育的3-4天接种

论文目录:

摘要

Abstract

文献综述

第一章 转基因禽类的研究进展

一、转基因动物的定义和发展

二、禽类转基因的研究策略

三、转基因动物的检测

四、转基因动物的应用

第二章 转基因研究中的免疫应答问题和解决策略

一、基因转移引起免疫应答

二、免疫耐受理论的提出及发展

三、影响免疫耐受形成的因素

四、禽类B细胞的发育

实验部分

第一章 输卵管组织特异性打靶载体及分泌型融合表达载体(Leptin和GFP)的构建

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

第二章 分泌型融合表达载体phLepGFP-secretion在真核细胞上的表达

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

第三章 鸡免疫耐受的初步研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

结论

研究工作展望

参考文献

致谢

附图

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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