间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及单克隆抗体的制备

论文摘要

疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染病,广泛流行于热带和亚热带一些发展中国家,同样也是对我国人民健康危害最严重的传染病之一。据WHO统计,全球每年有近3-5亿人感染疟疾,其中约300万人死亡。从近几年我国疟疾报告情况看,在26种甲、乙类法定报告传染病中,疟疾发病数始终处于第9位,死亡率排在12～14位,病死率排在12～17位不等;在自然疫源性及虫媒传染病中,疟疾报告发病数仅次于流行性出血热而始终居于第2位,占自然疫源性及虫媒传染病报告总数的28.25%～32.62%。因此,疟疾的快速诊断在其防治工作中就显得格外重要。目前的疟疾诊断方法主要有:1)以镜检为基础。如传统的厚,薄血膜法;QBC法等;2)免疫学诊断方法。如间接荧光抗体实验（IFAT）,ParaSight—F法,ICT法,Dipstick Opit MAL法;3)分子生物学方法。如DNA探针检测（同位素或非同位素标记）,PCR法。QBC法及Kawamoto法虽然敏感性比血涂片镜检法提高了8倍以上,特异性达98.4%,但其所使用的毛细管价格昂贵（每支0.8美元）,又不能重复使用,操作上也较繁琐,且难以有效地进行虫株鉴别及虫体计数,因此难以在基层推广应用。八十年代以来随着分子生物学的发展而出现的基因诊断技术（分子杂交,PCR、套式PCR、荧光定量PCR等）,显示了较高的敏感性和特异性,且能对疟原虫的感染作出早期快速的诊断,但也存在着需要特殊仪器设备和反应试剂较昂贵的问题。以免疫学为基础的血清学检测,特别是近几年来以单抗为基础的Dipstick技术,由于其操作简便、快速,结果易于判定,在疟疾诊断上日渐受到重视并展示了广阔的应用前景。该技术主要是利用单克隆抗体检测疟原虫的特异性抗原,即抗原捕获法检测。该法从取血、反应、结果判断,只需5～10分钟,而且多个样本可同时进行检测,不需特殊仪器,非常适合于基层医院和防疫部门使用。目前美国、澳大利亚等已开发出ParaSight-F（Becton Dickinson,Cockeysoville,Maryland,USA）、ICT Malaria P.f和ICT Malaria P.f/P.v（ICTDiagnostics,Sydney,Australia）、OptiMAL（Flow Inc,Portland Oreg）等快速免疫诊断试剂盒,现场评估均取得较好的效果。但这些试剂盒价格昂贵,且均存在一定的局限性,因而有必要寻找一种更具有诊断价值的新型靶抗原。本课题是基于疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp）同宿主动物LDH在理化、免疫学特性和酶学方面有很大的差异的基础上设计的。在催化乳酸生成丙酮酸反应中,LDHp能够迅速地利用NAD类似物3’—乙酰吡啶NAD（APAD）作为辅酶,而红细胞LDH（LDHr）在APAD存在时参与这一反应速率很慢;另外,LDHp具有种、属特异性,因而是检测疟原虫理想的靶抗原。由于LDHp仅由活虫体产生,血液中LDHp的水平与虫体血症呈平行相关,因此利用LDHp来检测还能鉴别虫体的死亡,由此可以鉴定疟原虫克隆株、监测药物的疗效及复燃情况。相比最早应用在疟疾快速诊断（Malaria rapid diagnostic tests,RDTs）中的富组氨酸蛋白-2（HRP-2）,LDH具有更好的诊断特异性,因为在疟疾得到治疗后,其pLDH能快速从血液中清除,从而避免因循环抗原的长期存在所造成的假阳性而导致滥用药物,因此也更能适应大规模流行区域的需要。本研究的最终目标是建立以LDH为诊断靶分子的免疫层析技术,使其能对间日疟原虫进行特异性诊断,同时能鉴别诊断恶性疟原虫。先前本实验室已经成功制备恶性疟原虫单克隆抗体及初步建立了相应的胶体金层析法。因此本研究的关键是获得能特异性针对间日疟原虫的单克隆抗体。但当时由于间日疟原虫不能体外培养,且又尚未获取间日疟原虫的LDH基因,故一直不能解决间日疟原虫抗原的来源问题。2004年Brown WM首先报道了SalvadorⅠ株LDH的部分基因序列,2005年Turgut—Balik D报道了Belem株的LDH全基因序列。本研究根据间日疟原虫SalvadorⅠ株LDH的部分基因序列,成功克隆了PvLDH的部分基因,将其构建成LDH/pGEX-4T-1表达载体,在大肠杆菌中进行表达。通过复性和柱层析技术纯化融合蛋白,并采用杂交瘤技术制备了针对该蛋白的单克隆抗体,且对抗体进行了初步鉴定。结果显示,利用PCR技术成功地钓取了编码我国间日疟原虫云南株乳酸脱氢酶LDHpv的基因序列。将LDHpv基因克隆到pGEX-4T-1表达质粒,经PCR、限制性酶切分析等鉴定,筛选到pGEX-LDH重组表达质粒。重组质粒在大肠杆菌BL21中得到高效表达,SDS-PAGE电泳显示表达蛋白质分子量约为56kDa,与理论值相符。表达产物超声破菌后进行SDS-PAGE分析,发现目的蛋白以包涵体形式存在。将包涵体洗涤溶解后,通过稀释复性和透析复性两张不同复性方法的比较,建立了以20mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,1mmol/L GSSG,0.1mmol/L GSH,pH8.0的复性工艺,并利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化,得到浓度为0.5mg/ml的蛋白溶液。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,ELISA法测免疫血清效价为1:51200,Western-blotting结果显示该血清能特异性地与间日疟和恶性疟患者全血抗原发生反应,而不与正常人起交叉反应,表明该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,融合细胞用HAT培养基作选择性培养。采用用纯化的pGEX-4T-1/LDH重组蛋白和纯化的GST蛋白同时进行筛选,筛选出只与pGEX-4T-1/LDH反应(OD450＞0.6),而不与GST蛋白反应(OD450＜0.1)的杂交瘤细胞株,经过3-4次亚克隆后获得分泌稳定的高效价和高特异性的抗LDH重组蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞5株,分别为6D1,6D2,5A10,5C7,4A8。5株单克隆抗体的培养上清的ELISA效价为1:256～1:512,其中有两株5C7、6D1经Western-blotting鉴定能与天然的恶性疟原虫和间日疟原虫的LDH发生特异性反应。以上结果表明,我们制备并获得了抗间日疟原虫LDH的单克隆抗体,此前,在国内尚无相关报道。这就为下一步努力开发出能同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫的快速诊断试剂盒,以便用于疫区和医院对疟疾的筛查和诊断,打下了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 间日疟原虫乳酸脱氢酶重组表达质粒的构建及鉴定
• 第一节 材料
• 1.1 主要材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 引物
• 1.4 主要仪器
• 1.5 细菌培养基
• 第二节 实验方法
• 2.1 间日疟原虫基因组DNA的提取
• 2.2 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.3 TA重组质粒的构建
• 2.4 阳性克隆的筛选及鉴定
• 2.4.1 PCR鉴定
• 2.4.2 酶切鉴定取阳性重组克隆
• 2.5 DNA序列测定及生物信息学分析
• 第三节 结果
• 3.1 PvLDH基因的扩增与鉴定
• 3.2 重组TA质粒的构建及鉴定
• 3.3 序列测定及其推导氨基酸序列的生物信息学分析
• 3.3.1 物理化学性质预测
• 3.3.2 同源性分析
• 3.3.3 抗原表位预测
• 3.3.4 保守功能域分析
• 3.3.5 二级结构预测
• 第四节 讨论
• 第二章 间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫原性研究
• 第一节 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 菌株及实验动物
• 1.3 主要仪器
• 1.4 溶液及培养基配制
• 第二节 实验方法
• 2.1 LDH融合蛋白的诱导表达
• 2.1.1 表达产物超声破菌后的SDS-PAGE分析
• 2.1.2 表达条件的优化
• 2.2 包涵体的提取
• 2.3 包涵体的溶解变性
• 2.4 包涵体的复性
• 2.4.1 稀释复性
• 2.4.2 透析复性
• 2.5 GST亲合层析纯化
• 2.6 表达产物鉴定
• 2.6.1 多抗的制备及鉴定
• 2.6.2 Western-blot分析
• 第三节 结果
• 3.1 LDH/pGEX-4T-1在大肠杆菌中的表达
• 3.2 表达条件的优化
• 3.2.1 诱导时机
• 3.2.2 诱导剂浓度
• 3.2.3 诱导温度
• 3.3 包涵体的洗涤
• 3.4 包涵体的复性
• 3.4.1 稀释复性
• 3.4.2 透析复性
• 3.5 GST亲和层析纯化
• 3.6 免疫学活性鉴定
• 第四节 讨论
• 第三章 单克隆抗体的制备及鉴定
• 第一节 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.1.1 蛋白电泳试剂
• 1.1.2 细胞培养试剂
• 1.1.3 其它试剂
• 1.1.4 细胞
• 1.1.5 动物
• 1.1.6 主要仪器
• 1.1.7 主要试剂配制
• 第二节 实验方法
• 2.1 抗原制备
• 2.2 动物免疫
• 2.3 细胞融合
• 2.4 阳性克隆的筛选与克隆化
• 2.5 诱生腹水
• 2.6 效价测定
• 2.7 单克隆抗体特异性鉴定
• 2.8 单克隆的稳定性鉴定
• 第三节 结果
• 3.1 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2 单克隆抗体培养上清的效价
• 3.3 单克隆抗体特异性鉴定
• 3.4 单克隆的稳定性
• 第四节 讨论
• 参考文献
• 成果
• 致谢