论文摘要
DNA甲基化是表观遗传修饰的主要形式之一,对哺乳动物的正常发育至关重要。体细胞中DNA甲基化模式是稳定的,但在早期胚胎中DNA会发生去甲基化和再甲基化。Oct4是一种与胚胎发育相关的多能调控因子,它在建立和维持细胞多能性方面起着重要作用。本试验以Oct4基因作为候选基因,运用亚硫酸氢盐测序法,对小鼠体细胞、生殖细胞以及早期胚胎发育过程中各个时期Oct4启动子区甲基化进行检测,并对其在体内和体外受精（in vitro fertilization,IVF）胚中的甲基化进行比较。试验所获得的各种检测材料经低熔点琼脂糖包埋、亚硫酸氢盐变性处理后进行巢式PCR扩增。然后将PCR产物进行纯化、连接、转化于感受态大肠杆菌中。对转化后的菌体进行菌体PCR鉴定,将有特异性条带的菌液送检测序。对测序结果进行分析,结果显示:（1）体细胞基因组中Oct4启动子区呈高度甲基化状态（73.8±5.9%,平均数±标准差）,极显著高于精子和卵子（P＜0.01）;精子和卵子之间甲基化水平也存在显著差异（P＜0.05）,精子中略微甲基化（18.75±4.1%）,而卵子中基本上是非甲基化的（2.5±1.4%）。（2）小鼠体内各时期胚胎Oct4启动子区均呈低甲基化状态,2-细胞、4-细胞、8-/16-细胞和桑椹胚时期甲基化水平分别为5.63±2.5%、4.38±2.0%、3.75±1.4%、1.88±0.2%,甲基化逐渐丢失,但无显著性差异（P＞0.05）;而在囊胚期,Oct4启动子区甲基化水平显著升高（6.88±2.4%,P＜0.05）,重新甲基化开始。（3）小鼠体外受精胚与体内胚甲基化模式相似,其各时期胚胎Oct4启动子区也呈低甲基化状态,从2-细胞至桑椹胚,随着胚胎发育而呈下降趋势,相互之间差异不显著（P＞0.05）,分别为11.25±4.5%（2-细胞）、6.25±2.1%（4-细胞）、5.63±3.7%（8-16-细胞）、1.88±0.2%（桑椹胚）;而在囊胚期,甲基化水平显著升高（7.5±2.4%,P＜0.05）。（4）对比体外与体内各时期胚胎Oct4启动子区甲基化水平,体外2-细胞胚甲基化水平显著高于体内2-细胞胚（P＜0.05）,其余各时期胚胎虽均高于体内胚,但相互之间无显著性差异。以上结果表明,小鼠体外受精胚在早期发育过程中也能发生较有效的重编程,所构建的胚胎部分可以发育至囊胚,但其各个时期的甲基化水平均要高于相应时期的体内胚,尤其在2-细胞期,这可能是造成体外受精胚发育到期的比例低于体内受精胚的原因。