睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD/CR等基因的表达调控研究

论文题目: 睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD/CR等基因的表达调控研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物栽培学与耕作学

作者: 戴艺民

导师: 潘大仁

关键词: 睾丸酮丛毛单胞菌,幽类物质,活化因子,基因工程菌

文献来源: 福建农林大学

发表年度: 2005

论文摘要: 人类活动将类固醇类物质(如雌二醇(E2)、口服避孕药)、多环芳香烃(PAHs)及杀虫剂等化合物大量排入环境中,这些物质已经引起生态破坏,不育、癌症等各种疾病日益增多。在众多的环境激素物质中,类固醇类物质不但非常稳定而且其激素活性大大高于其他环境激素类物质。C.testosteroni具有降解甾核的关键酶3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶(3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase,3α-HSD/CR)基因,因此能够以睾丸酮、孕酮和胆汁酸等类固醇类物质为唯一碳源和能源,通过包含许多酶的氧化甾核的复杂代谢途径,完全消化这类底物,因此该菌在这些危害大的稳定化合物的生物修复中起重要作用。然而,涉及这些物质降解的酶在该菌中是诱导表达的。为更好发挥C.testosteroni的作用,本研究对该细菌的一些基因进行克隆、载体构建和在大肠杆菌里进行表达:并对原始菌进行改造,检测。结果如下: 1.提取C.testosteron.的基因组DNA,利用PCR扩增3α-HSD/CR和activator基因.构建了相应的表达载体pET-15b-3α和pET-15b-actl,并在大肠杆菌BL21里进行了诱导表达,为蛋白质纯化、抗体的制备打下基础。 2.提取C.testosteroni的基因组DNA,利用PCR扩增activator基因。以具有tac强启动子的质粒pKtac1为载体,构建了2个含有C.testosteroni activator基因的质粒:pKtac1-actl(564bp全长activator基因)和pKtac1-act2(409bp部分activator基因)。这2个质粒经测序后发现:pKtac1-act1和pKtac1-act2在tac启动子的-35区保守序列都为TTGACA;在-10区保守序列pKtac1-actl为TATAAT,而pKtac1-act2却突变为TATGTT。将pKtac1-actl和pKtac1-act2分别进行酶切和连接,获得重组质粒pKtac1-act3(含启动子-10保守区为TATAAT,409bp的部分activator基因)和pKtac1-act4(含启动子-10保守区为TATGTT,564bp的全长activator基因)。 3.酶联免疫分析(ELISA)测定4个重组质粒分别转化(或与含3α-HSD/CR基因的质粒pAX1共转化)宿主菌Escherichia coli HB101的细菌总蛋白质中的activator和3α-HSD/CR的表达量。结果说明:启动子-10保守区为TATAAT的质粒比-10保守区为TATGTT的质粒有更高的转录活性;actvitor的过量表达可能影响质粒pKtac1-act3表达的稳定性;启动子-10区保守序列的下降突变(pKtac1-act2,TATAAT→TATGTT)及tac启动子的丢失(pKtac1-act3,继代培养4次)揭示了宿主菌E. coli HB101的自身防护机制;过高的细菌C.testosteroni activator表达可能对大肠杆菌有毒性,因此细菌启动本身的防护机制,对启动子保守区进行了下降突变修饰或者对强启动子进行剔除。 4.利用电穿孔转化法分别将质粒pKtac1-actl和pKtac1-act2同源整合到C.testosteroni的

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1 类固醇化合物

1.1 甾体的结构与取代特征

1.2 甾醇的种类

1.3 生物体内类固醇的转运

1.4 类固醇激素的作用

1.5 类固醇含量的检测

2 类固醇化合物的微生物降解

2.1 微生物对甾体转化的反应类型和他的反应机理

2.1.1 羟化反应机理

2.1.2 脱氢反应机理

2.2 微生物对甾醇侧链的降解

2.3 微生物对甾体母核的降解

3 睾丸酮丛毛单胞菌研究进展

3.1 睾丸酮丛单胞毛菌

3.2 类固醇底物对睾丸酮丛毛单胞菌酶的诱导表达

3.2.1 TIP1

3.2.2 TIP4

3.2.3 TIP8

3.2.4 TIP11

3.2.5 其它一些酶

3.3 羟类固醇脱氢酶(HSDs)的特性

3.3.1 3α-HSDs介导的反应

3.3.2 C testosteroni的3α-HSD／CR是SDR家族的新成员

3.3.3 C testosteroni的3α-HSD／CR的三维结构

3.4 C. testosteroni 3α-HSD／CR基因附近的基因组成

3.5 类固醇对Comamonas testosteroni ATCC119963 3α-HSD／CR基因的表达调控

3.5.1 操纵基因

3.5.2 抑制子RepA

3.5.3 抑制子RepB

4 基因的表达调控

4.1 转录水平的调控

4.1.1 DNA结合蛋白

4.1.2 操纵子的转录调控

4.1.2.1 启动子

4.1.2.2 增强子

4.1.2.3 负控诱导系统

4.1.2.4 负控阻遏系统

4.1.2.5 正控诱导系统

4.1.3 细菌的应急反应

4.1.4 通过σ因子更换的调控

4.1.5 信号传导和二组分调节系统

4.1.6 多启动子调控的操纵子

4.2 转录后调控

5.工程菌改造策略

5.1 原生质体融合技术

5.2 基因重组技术

5.2.1 质粒转移构建多质粒菌株

5.2.2 利用质粒突变筛选高效降解工程菌

5.2.3 DNA改组技术

6 存在问题和本研究的意义

第二章 3A-HSD／CR、ACTIVATOR基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

1.1.2 培养基

1.1.3 酶、生化试剂及试剂盒

1.1.4 ELISA

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

1.2.2 表达载体的构建

1.2.2.1 3α-HSD／CR表达载体的构建

1.2.2.2 Activator表达载体的构建

1.2.3 质粒pKtacl-act1、pKtacl-act2、pKtacl-act3和pKtacl-act4的构建与检测

1.2.3.1 质粒pKtacl-act1和pKtacl-act2的构建

1.2.3.2 质粒pKtacl-act3和pKtacl-act4的构建

1.2.3.3 重组质粒的稳定性检测

1.2.3.4 重组质粒的activator表达检测

1.2.3.5 重组质粒分别与pAXl一起转化大肠杆菌的3α-HSD／CR和activator检测

1.2.4 细菌总蛋白的测定

1.2.5 ELISA检测

2 结果与分析

2.1 3α-HSD／CR表达载体的构建(pET-15b-3α)

2.2 Activator表达载体的构建

2.3 质粒pKtacl-act1、pKtacl-act2、pKtacl-act3和pKtacl-act4的构建

2.3.1 质粒pKtacl-act1和pKtacl-act2的构建

2.3.2 质粒pKtacl-act3和pKtacl-act4的构建

2.3.3 质粒pKtacl-act1、pKtacl-act2、pKtacl-act3和pKtacl-act4的启动子区序列分析

2.4 质粒pKtacl-act1、pKtacl-act2、pKtacl-act3和pKtacl-act4的检测

2.4.1 稳定性检测

2.4.2 重组质粒转化大肠杆菌的的activator表达检测

2.4.3 重组质粒分别与pAXl一起转化大肠杆菌的3α-HSD／CR和activator检测

3 讨论

3.1 表达载体的作用

3.2 activator的作用

3.3 细菌的防御机制与重组质粒的稳定性

3.4 抗体的特异性

第三章 基因工程菌的构建

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 利用PCR筛选基因工程菌

2.2 基因工程菌的Southern检测

2.3 睾丸酮对细菌的诱导

2.4 工程菌稳定性的检测

2.4.1 不添加抗生素进行连续传代培养的3α-HSD／CR检测

2.4.2 不添加抗生素进行连续继代培养的activator检测

2.4.3 添加抗生素进行连续继代培养的3α-HSD／CR检测

2.4.4 添加抗生素进行连续继代培养的activator检测

2.4.5 Activator对3α-HSD／CR表达的影响

2.5 RT-PCR检测

2.6 双向电泳的结果

3 讨论

小结

1 主要结论

2 本研究的主要创新点

3 进一步研究展望

4 已发表相关论文

参考文献

附录Ⅰ 类固醇的生物转化、合成简图

附录Ⅱ RNA聚合酶及其与启动子的相互作用

附录Ⅲ 缓冲液等的配制

附录Ⅳ 缩写词和英汉对照

致谢

发布时间: 2005-09-27

参考文献

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• [2].Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D]. 杨森.江南大学2017

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