真菌感染的东亚飞蝗脂肪体、血细胞均一化cDNA文库构建和分析

论文摘要

在最近的20多年里,昆虫免疫在其基础和应用研究上都得到极大的关注,成为目前研究的热点之一。然而,大部分的研究主要是对由细菌诱导的昆虫免疫,从分子水平研究真菌诱导的昆虫免疫的报道还比较匮乏,同时真菌作为良好的免疫诱导物和微生物杀虫剂,因此越来越多引起人们的重视。绿僵菌是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在生物防治中起着重要的作用,东亚飞蝗属直翅目昆虫,是不完全变态昆虫的代表和世界性的农业害虫,在长期进化过程中,形成了自身的免疫体系,在生物学研究方面具有重大的现实意义。研究真菌感染东亚飞蝗后的基因转录信息能获取分子昆虫学方面无价的信息,并能为医学,农业学,生态学相关昆虫的比较学研究开辟新的道路。同时还可以能更好地理解昆虫应对真菌感染的防卫机制,识别昆虫防卫基因,进而为生产高效的真菌杀虫剂加快对有害昆虫的生物防治提供新的策略。本文以东亚飞蝗为研究材料,采用注射绿僵菌孢子,诱导其产生免疫反应,提取脂肪体和血细胞的mRNA,并通过RT-PCR和PCR验证无真菌DNA和mRNA污染,采用SMART技术和DSN均一化技术,首次成功地构建了真菌感染的昆虫均一化cDNA文库。随机挑取200个阳性克隆测序,得到190条ESTs （expressed sequence tags）序列（165个unigenes）,其中未发现真菌基因的存在,同时也识别了重要的代谢、免疫相关、受体、转录控制因子、肽酶、细胞骨架、线粒体等基因,结果表明该方法用于构建真菌感染昆虫的cDNA文库是可靠、有效的。主要研究结果如下:1.根据绿僵菌Tubulin基因和蝗虫的Histone基因分别设计了绿僵菌特异性引物Tu1、Tu2和蝗虫特异引物H1、H2,并对其进行了特异性和灵敏度分析。结果为:两对引物经交叉检测,均为阴性。蝗虫特异引物H1、H2能检测出1 pg的蝗虫DNA,绿僵菌特异性引物Tu1、Tu2能检测出10 pg绿僵菌DNA.2.将感染真菌的蝗虫的脂肪体和血细胞为材料提取mRNA,通过RT-PCR,以绿僵菌特异引物Tu1、Tu2和蝗虫特异引物H1、H2进行验证。结果表明,从绿僵菌侵染后的蝗虫中分离到的脂肪体和血细胞mRNA中无真菌DNA和RNA的污染。3.本研究首次构建了以真菌感染的昆虫血细胞和脂肪体为材料的均一化cDNA文库。随机挑选了200个cDNA克隆进行测序和分析。分别通过Blast-X, Blast-N与GenBank数据库进行比对,没有发现任何序列与真菌基因有着明显的相似性。其中有57%的cDNA序列却没有明显的相似性(E value>10-5), 43%的cDNA序列与真菌的基因有明显的相似性(E value<10-5).

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 昆虫免疫研究
• 1.2.1 细胞免疫
• 1.2.2 体液免疫
• 1.2.3 昆虫免疫信号通路
• 1.4 昆虫免疫反应研究进展
• 1.5 cDNA 文库
• 1.6 均一化文库
• 1.6.1 常用的均一化技术
• 1.6.2 均一化的理论基础
• 1.6.3 基于DSN 的均一化技术
• 1.7 立题依据和研究目标
• 1.7.1 立题依据
• 1.7.2 研究目标
• 1.8 研究内容和技术路线
• 1.8.1 研究内容
• 1.8.2 技术路线
• 1.9 本研究创新之处
• 2 材料与方法
• 2.1 供试虫源
• 2.2 供试菌株
• 2.3 主要仪器
• 2.4 主要试剂
• 2.4.1 提取东亚飞蝗基因组DNA 所用试剂
• 2.4.2 提取绿僵菌基因组DNA 所用试剂
• 2.4.3 mRNA 提取所用试剂与材料
• 2.4.4 PCR 和RT-PCR 所用试剂
• 2.4.5 培养基和部分储存液的配制
• 2.4.6 cDNA 文库构建所用试剂与材料
• 2.5 基因组DNA 的制备与定量
• 2.5.1 东亚飞蝗基因组DNA 的提取
• 2.5.2 绿僵菌基因组DNA 的提取
• 2.5.3 基因组DNA 的定量
• 2.6 绿僵菌侵染飞蝗后的观察
• 2.6.1 东亚飞蝗饲养
• 2.6.2 绿僵菌的培养和孢子悬浮液的制备
• 2.6.3 东亚飞蝗的处理
• 2.6.4 东亚飞蝗血淋巴收集和观察
• 2.7 mRNA 的提取
• 2.7.1 东亚飞蝗脂肪体和血细胞mRNA 的提取
• 2.7.2 绿僵菌mRNA 的提取
• 2.7.3 mRNA 的定量
• 2.8 引物设计及PCR 灵敏度分析
• 2.8.1 东亚飞蝗引物设计及灵敏度分析
• 2.8.2 绿僵菌引物的设计及灵敏度分析
• 2.8.3 PCR 灵敏度分析
• 2.8.4 提取分离到的绿僵菌菌体的mRNA 并进行RT-PCR 纯度分析
• 2.9 cDNA 文库构建
• 2.9.1 cDNA 第一链的合成
• 2.9.2 cDNA 第二链的合成
• 2.9.3 全长cDNA 的均一化
• 2.9.4 均一化效果检测
• 2.9.5 cDNA 片段的酶切和分级分离
• 2.9.6 cDNA 与载体pDNR-lib 连接
• 2.9.7 感受态制备与电转化
• 2.9.8 文库质量的鉴定
• 2.9.9 测序和cDNA 序列分析
• 3 结果
• 3.1 引物灵敏度和特异性分析结果
• 3.1.1 绿僵菌特异性引物灵敏度检测结果
• 3.1.2 东亚飞蝗特异性引物灵敏度检测结果
• 3.1.3 引物特异性分析结果
• 3.2 东亚飞蝗血淋巴观察
• 3.3 mRNA 的分离
• 3.4 提取感病蝗虫脂肪体和血细胞mRNA 后进行RT-PCR 分析
• 3.5 全长cDNA 的合成
• 3.6 均一化效果检测
• 3.7 文库滴度和插入片断大小分析
• 3.8 测序结果分析
• 4 讨论
• 4.1 绿僵菌的检测和东亚飞蝗mRNA 提取
• 4.2 均一化文库
• 4.3 部分序列功能分析
• 5 结论及后续工作
• 致谢
• 参考文献
• 附录