IBR间接ELISA的建立及重组gE糖蛋白与单抗的研制

论文摘要

以牛肾细胞系（MDBK）培养牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）Bartha Nu/67株,经超速离心纯化病毒,再经超声破碎处理后作为诊断抗原,建立了检测牛血清IBRV抗体的间接酶联免疫吸附试验。以IBRV Bartha Nu/67株的DNA作为模板,分六段扩增编码糖蛋白E的基因,并克隆至pET32a表达载体中。在大肠杆菌中进行表达,其中两个为可溶性重组蛋白pET32gEE和pET32gEB。重组蛋白纯化后,经免疫印迹试验和间接ELISA检测证明具有良好的抗原性和特异性。以重组蛋白pET32gEE为诊断抗原成功建立了检测gE抗体的间接ELISA诊断方法。应用IBRV全病毒及gE-ELISA诊断方法分别检查了我国部分地区的牛血清,结果这些地区的IBRV感染率分别为67.10%和68.74%。用纯化的IBRV、重组pET32gEE和pET32gEB蛋白为免疫原,分别免疫Balb/C小鼠,通过杂交瘤技术获得了3株分泌抗IBRV单克隆抗体（McAb ）的杂交瘤细胞;2株分泌抗gEE单克隆抗体的杂交瘤细胞和2株分泌抗gEB单克隆抗体的杂交瘤细胞。这些单克隆抗体用双抗体夹心ELISA试验可区别IBRV阳性血清与阴性血清;同时gEE单抗和gEB单抗可初步区别gE缺失株和gE非缺失株。

论文目录

• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 牛传染性鼻气管炎病毒的研究概况
• 1 牛传染性鼻气管炎病毒概述
• 2 牛传染性鼻气管炎病毒的分子生物学研究进展
• 第二章 牛传染性鼻气管炎病毒主要糖蛋白及gE 基因研究进展
• 1 IBRV 主要糖蛋白的研究进展
• 2 IBRV 糖蛋白gE 基因及其研究进展
• 第三章 牛传染性鼻气管炎的诊断
• 1 病原学诊断
• 2 血清学诊断
• 3 鉴别诊断
• 第二篇 研究报告
• 第一章 牛传染性鼻气管炎间接 ELISA 诊断方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 抗原和兔抗牛 IgG 辣根过氧化物酶标抗体最佳稀释度的确定
• 2.2 阴﹑阳性血清最佳稀释度的确定
• 2.3 底物最佳作用时间的确定
• 2.4 特异性试验
• 2.5 重复性试验
• 2.6 判定标准的确定
• 2.7 对比试验
• 2.8 ELISA 诊断方法的初步应用
• 3 讨论
• 第二章 牛传染性鼻气管炎病毒gE 基因的克隆表达与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 糖蛋白gE 基因各片段的扩增与克隆
• 2.2 糖蛋白gE 基因各片段的表达
• 2.3 重组蛋白gEB、gEE 的纯化
• 2.4 免疫印迹结果
• 3 讨论
• 第三章 牛传染性鼻气管炎病毒重组gE 蛋白间接 ELISA 诊断方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组抗原的制备
• 2.2 抗原和兔抗牛IgG 辣根过氧化物酶标抗体最佳稀释度的确定
• 2.3 阴﹑阳性血清最佳稀释度的确定
• 2.4 底物最佳作用时间的确定
• 2.5 pET32a 空载体表达蛋白与血清样品阻断浓度的确定
• 2.6 特异性试验
• 2.7 重复性试验
• 2.8 判定标准的确定
• 2.9 对比试验
• 2.10 ELISA 诊断方法的初步应用
• 3 讨论
• 第四章 牛传染性鼻气管炎病毒及其gE 蛋白单克隆抗体的制备及应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 免疫抗原的制备
• 2.2 免疫小鼠血清抗体效价的测定
• 2.3 细胞融合
• 2.4 杂交瘤细胞的筛选
• 2.5 小鼠腹水效价的测定
• 2.6 杂交瘤细胞染色体数的检测
• 2.7 抗体亚类的测定结果
• 2.8 中和试验
• 2.9 免疫荧光试验
• 2.10 杂交瘤细胞株抗体分泌稳定性的测定
• 2.11 单克隆抗体的初步应用
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文
• 中文摘要
• 英文摘要
• 导师及作者简介
• 致谢