乙型肝炎病毒影响肝细胞干扰素诱生的初步研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是目前严重危害全世界人类健康的病原体,其感染的危害性,主要在于病毒在被感染者体内持续感染,导致机体产生慢性肝炎、肝损伤和肝硬化,并且与肝细胞癌的发生密切相关。天然免疫中的干扰素（interferon,IFN）系统在抗病毒过程中发挥重要作用,干扰素不仅对病毒具有直接的抗病毒作用,而且能启动并调节适应性免疫。导致HBV慢性感染的具体机制尚不十分清楚,但是已有的研究提示HBV的持续感染或拮抗病毒治疗与病毒逃避宿主天然免疫尤其是干扰素密切相关,如慢性乙肝患者中仅有30%～40%能对干扰素单独治疗有较好的应答,提示HBV对干扰素的抗病毒作用具有拮抗作用;在肝细胞内,已发现HBV能通过干扰转录因子STAT1的转运入核或影响STAT1的甲基化来抑制干扰素的抗病毒信号通路,并且HBV的核心蛋白Core和Pre-core可以结合抗病毒基因Mx的启动子以抑制Mx的表达。这些临床和基础研究结果充分提示,HBV在肝细胞内确实能拮抗干扰素抗病毒作用。但是,HBV在肝细胞内是否拮抗肝细胞干扰素的产生及其机制尚不清楚。尽管有报道提示HBV的Core蛋白能够在体外抑制IFN-β的产生,但其作用及其机制尚未在肝细胞内得到证实。鉴于已有报道提示肝细胞本身具有很强的干扰素产生能力,HBV是否影响肝细胞自身的干扰素产生将影响到病毒能否逃脱先天免疫的监视及其慢性感染的建立。因此,极有必要研究和了解HBV对肝细胞干扰素产生及信号通路的影响及其机制。为研究HBV影响肝细胞干扰素产生的作用,首先比较了不同来源的肝细胞干扰素的诱生能力。分别以干扰素产生的强烈诱导剂新城疫病毒（Newcastledisease virus,NDV）刺激肝癌细胞Huh7、HepG2和肝原代细胞系PH5CH8,定量实时PCR结果显示,与Huh7和HepG2细胞仅能微弱地被诱导产生IFN-β相比,而PH5CH8细胞则能被诱导强烈地产生干扰素,提示原代肝细胞具有较强的干扰素产生能力,因此可将PH5CH8细胞作为本研究的对象。为研究HBV对肝细胞干扰素诱生的影响,在PH5CH8细胞中转染HBV复制质粒pHBV3.8并以NDV刺激,逆转录PCR结果提示,转染HBV复制质粒组PH5CH8细胞的IFN-βmRNA水平显著低于对照组,提示HBV在肝细胞内复制能抑制肝细胞自身干扰素的诱生。为进一步了解病毒复制与蛋白表达对干扰素产生的影响,PH5CH8细胞中分别转染HBV复制型质粒pCMV-HBV和非复制质粒pHBV-YMDD,结果提示与对照相比,HBV复制型质粒能抑制细胞IFN-β的表达,而非复制型质粒则无影响。为进一步研究HBV对肝细胞干扰素诱生的作用,在PH5CH8细胞中共转IFN-β启动子报告质粒和乙型肝炎病毒各个蛋白表达质粒并以NDV刺激,双荧光报告基因检测结果提示,与对照组相比,转染HBV多聚酶（Polymerase）组的IFN-β启动子活性显著低于对照组,而转染Core和X蛋白（HBx）组则无显著差异,进一步提示HBV polymerase可能在HBV抑制肝细胞干扰素诱生过程中发挥重要作用。为验证上述现象,在Huh7细胞中分别转染HBV各蛋白表达质粒并转染Poly（I∶C）,实时定量PCR结果提示HBV多聚酶能显著地抑制Huh7细胞中经Poly（I∶C）诱导的IFN-β的表达,而Core和HBx则对IFN-β的诱生无影响,进一步提示了HBV多聚酶在抑制肝细胞干扰素诱生中的作用。为进一步明确HBV多聚酶在抑制肝细胞干扰素诱生中的作用,将不同剂量的HBV多聚酶表达质粒和IFN-β启动子报告质粒共转PH5CH8细胞并分别以Poly（I∶C）和NDV刺激,结果提示HBV polymerase能以剂量依赖的形式抑制IFN-β启动子的活性。此外,实时定量PCR结果提示HBV多聚酶亦能以剂量依赖的形式抑制Poly（I∶C）和NDV诱导的IFN-β的mRNA水平。以上结果提示HBV多聚酶可能是一个HBV拮抗肝细胞干扰素诱生的病毒性调节因子。HBV多聚酶蛋白从N端至C端依次由末端蛋白（TP）、间隔区（Spacer）、DNA聚合酶/逆转录酶活性区（DNA Pol/RT）和RNA酶活性区（RNaseH）组成。为了明确HBV多聚酶的哪一段区域可能在HBV及其多聚酶抑制肝细胞干扰素诱生中的作用,分别将表达HBV多聚酶不同截短体的质粒与IFNβ启动子报道质粒共转PH5CH8细胞,结果提示各截短体对肝细胞干扰素的产生都有不同程度地抑制作用,但是N端691位、347位和178氨基酸序列突变体具有显著的抑制效果,而缺失末端蛋白的截短体虽有抑制作用。但其抑制活性大大降低,提示末端蛋白在HBV多聚酶抑制肝细胞干扰素的诱生过程中发挥主要作用,但也依赖于间隔区和聚合酶活性区的作用。由于HBV能抑制分别由Poly（I∶C）和NDV诱导的干扰素的产生,而这两者激活的信号通路交汇于由TBK1/IKKε激活的转录因子IRF-3,因此,为研究HBV抑制肝细胞干扰素及其信号通路的分子机制,在Huh7细胞中共转IFN-β启动子报告质粒、TBK1/IKKε、IRF-3和HBV复制质粒,结果提示HBV能显著地抑制TBK1/IKKε激活的IFN-β启动子的活性,进一步提示HBV可能通过抑制TBK1/IKKε下游的信号通路来抑制肝细胞中干扰素的产生。鉴于IRF-3及其磷酸化激活在干扰素产生信号通路中的重要作用,将HBV复制质粒转染PH5CH8细胞,并分别以Poly（I∶C）和NDV刺激,通过Western blot来检测细胞IRF-3的表达及其磷酸化状态,结果提示与对照组相比,HBV对IRF-3的磷酸化状态无显著影响。进一步转染HBV各蛋白表达质粒,结果提示这些蛋白对IRF-3的磷酸化状态均无显著影响,提示HBV可能通过其它机制抑制肝细胞干扰素的诱生。综上所述,本研究结果发现HBV在肝细胞中复制时能抑制肝细胞自身干扰素的诱导水平,提示这可能是HBV逃避干扰素系统及先天免疫的策略之一。本研究还发现HBV多聚酶在HBV抑制肝细胞干扰素诱生中发挥重要作用,并且作用于激酶TBK1/IKKε激活的信号通路下游。对HBV多聚酶抑制肝细胞干扰素信号通路机制的进一步研究,将有助于揭示HBV拮抗干扰素产生系统和逃避免疫的具体分子机制,也可能揭示HBV在肝细胞建立慢性感染的分子机制,并为设计和开发针对病毒的新药物以及提高干扰素的疗效等提供理论依据和实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 论文小结
• 参考文献
• 综述
• 附录
• 致谢