大肠杆菌cysE和cysM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

论文摘要

山羊绒的主要组成成分是角蛋白,角蛋白同时又是多种氨基酸的组合体,其中含量最高的是谷氨酸和胱氨酸,胱氨酸是含硫氨基酸。羊等哺乳动物自身不能直接合成半胱氨酸,只能依靠反式硫化蛋氨酸间接的合成半胱氨酸。利用转基因技术,将半胱氨酸合成酶转移至绒山羊体内,使得羊体自身能够高效的合成半胱氨酸,对山羊绒品质的提高有极大促进作用。本研究旨在通过PCR扩增大肠杆菌（Escherichia coli）丝氨酸乙酰转移酶基因（cysE）和O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶基因（cysM）,构建质粒载体进行原核表达,并制备相应的蛋白多克隆抗体,为生产半胱氨酸合成酶转基因绒山羊奠定方法与技术基础。（1）从大肠杆菌基因组DNA中扩增cysE基因,长度为822 bp,编码274个氨基酸残基,cysM基因全长912 bp,编码304个氨基酸残基,各为1个完整的开放阅读框。测序后得到的序列,与Genbank公布的cysE（8177668）和cysM（8176794）序列相比对,同源性达到100%。经基因重组成功构建原核表达载体pET32a-cysE和pET32a-cysM,并可在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导后实现高效表达。（2）原核表达载体pET32a-cysE和pET32a-cysM在大肠杆菌BL21（DE3）经1 mmol/L IPTG诱导,37℃下,表达6 h,目的蛋白表达量超过全部菌蛋白表达量的25%。通过Ni-Agrose亲和柱纯化,从细菌裂解上清液中纯化得到了cysE和cysM融合蛋白。SDS-PAGE结果显示,亲和柱纯化法得到的融合蛋白纯度可达90%,回收效率达60%。（3）用纯化的cysE和cysM蛋白作为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价,抗体滴度分别达到1:102.4K,表明纯化制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。同时,以兔血清为一抗,HRP标记的羊抗兔IgG为二抗,对得到的cysE和cysM融合蛋白进行Western blot检测,表明试验获得抗体对原核表达的cysE和cysM融合蛋白具有特异性反应。通过本研究建立了大肠杆菌cysE和cysM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备的方法与技术。为进一步研究半胱氨酸合成酶转基因绒山羊奠定了技术基础,具有重要理论与育种实践价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 半胱氨酸合成酶基因cysE 和cysM 的研究进展
• 1.1.1 半胱氨酸合成酶基因的组成及简介
• 1.1.2 cysE 和cysM 的国内外研究进展
• 1.2 原核表达载体
• 1.3 多克隆抗体的优点及其制备原理
• 1.3.1 抗体
• 1.3.2 单克隆抗体与多克隆抗体
• 1.3.3 多克隆抗体的制备与鉴定
• 1.4 研究目的及意义
• 1.5 本研究的技术路线
• 第二章 cysE 和cysM 基因的克隆及表达载体的构建
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要仪器与设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 cysE 和cysM 基因的获得
• 2.2.2 pET 表达质粒的构建及鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 大肠杆菌DNA 提取结果
• 2.3.2 cysE 和cysM 基因的克隆
• 2.3.3 原核表达质粒的构建及鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 cysE 和cysM 基因重组蛋白的表达、纯化
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 主要仪器与设备
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要溶液的配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 cysE 和cysM 基因的诱导表达
• 3.2.2 cysE 和cysM 基因表达产物SDS-PAGE 电泳分析
• 3.2.3 cysE 和cysM 基因表达产物大量表达及纯化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 cysE 和cysM 基因表达产物SDS-PAGE 电泳分析
• 3.3.2 cysE 和cysM 基因表达产物的纯化
• 3.4 讨论
• 第四章 cysE 和cysM 蛋白多克隆抗体的制备及检测
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 试验动物
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 主要仪器与设备
• 4.1.4 主要溶液的配制
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 cysE 和cysM 蛋白的乳化
• 4.2.2 免疫供试兔
• 4.2.3 检测抗体效价
• 4.2.4 抗体特异性检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 抗体效价检测
• 4.3.2 抗体特异性检测
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介