牛分枝杆菌和BCG感染对小鼠树突状细胞精氨酸代谢的影响

论文摘要

结核病是一种由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis Complex）引起的重要的人畜共患病,包括人和牛在内的多种动物均可以感染结核病。人与动物的结核病难以根除的一个重要原因在于结核分枝杆菌的持续感染问题。一旦结核分枝杆菌进入机体细胞后,机体的免疫系统会对分枝杆菌做出免疫应答,早期主要是细胞免疫,晚期则是以体液免疫为主,但是结核分枝杆菌有着极其精巧的免疫逃避和潜伏持续感染机制如改变自身的代谢方式、干扰吞噬溶酶体的形成、影响巨噬细胞的活化进而影响T细胞抗原识别、诱导细胞发生凋亡等。为了探寻牛分枝杆菌持续感染的潜在分子机制,前期采用小鼠全基因组芯片技术检测了牛分枝杆菌强弱菌株感染小鼠树突状细胞后差异基因转录表达情况,发现了36个差异在2倍以上的表达基因,其中包括与精氨基酸代谢相关的基因Slc7A2和Slc7A1,精氨酸是细胞内活性氮中间物（RNI）产生的前体物质,而RNI是抗细菌感染的重要物质,是先天性免疫研究的重点关注对象。因此,本论文研究牛分枝杆菌强弱菌株感染对树突状细胞精氨酸代谢途径的调节,进一步揭示NO（活性氮中间物的一种）的产生机制及其效应反应,以期为阐明牛分枝杆菌持续感染和免疫逃避机制提供理论依据。本研究主要取得以下结果：（1）感染对树突状细胞NO产生的影响采用Griess Reagent系统检测上清中NO的含量,结果显示,感染组中的上清NO含量表现增高趋势,随着感染时间的增加,NO的含量也在增加。且在感染24h后,BCG感染组要比M.bovis感染组要高,浓度分别为12.57和12.04μM。（2）感染对阳离子氨基酸转运蛋白（CAT）基因和诱导型一氧化氮合酶转录表达的影响采用相对荧光定量PCR方法,针对精氨酸代谢通路中的几个关键基因进行定量。结果显示,与未感染组相比,感染组中的Slc7A2基因的mRNA含量均上调,且BCG感染组中均比M.bovis感染组要高（4.263倍,3.14倍）,并且外源添加小鼠IFN-y后,与未添加小鼠IFN-y相比,无论是在感染BCG或者是M.bovis隋况下,Slc7A2的mRNA含量均有较大幅度的上升（5.696倍VS 4.263倍、12.247倍VS 3.14倍）。Slc7A1基因的结果也表现出相似趋势；与未感染组相比,iNOS的mRNA含量均上调,且感染BCG要比感染M.bovis高（5.328倍、1.247倍）。由于iNOS是受到Th1型细胞因子的调控,在添加小鼠IFN-y后,iNOS的mRNA含量均表现出较大幅度的上调,上调倍数分别达到13.362倍和15.345倍。（3）感染对精氨酸酶基因的转录表达的影响小鼠树突状细胞中检测到了两种亚型的精氨酸酶存在。在感染BCG和M.bovis24h后,两种arginase虽在DC中均有转录,但arginaseⅠ比arginaseⅡ的1mRNA水平转录要多；与未感染组相比较,BCG和M. bovis感染组的arginaseⅠ分别达到29.925倍和9.812倍,而arginaseⅡ只有0.231倍和0.432倍,由此可推测在DC感染BCG和M. bovis过程中,精氨酸酶Ⅰ型占主导优势。（4）细胞凋亡检测应用PI单染法通过流式细胞仪检测树突状细胞凋亡发生比例,结果发现（仅BCG感染组）,除了Toll样受体4的抗体处理组外,其他处理组的凋亡发生比例均要比BCG感染组低。采用PDTC处理的BCG感染组中,树突状细胞的凋亡比例由21.73%下降到12.7%；TLR2抗体处理组下降到16.82%；TLR2抗体和TLR4抗体共同处理组则下降到16.625%；而TLR4抗体处理组则上升到27.05%。由上可见,NO在一定程度上参与了树突状细胞凋亡的发生。（5）细菌胞内存活检测预感染24h后,采用平板计数的方法对胞内细菌进行培养计数。BCG感染组胞内菌数量为139500±28723 CFU/孔,而M.bovis感染组为82500±27000 CFU/孔,差异显著（p=0.027）。但是,当添加IFN-γ（100ng/mL）后,BCG感染组则下降到82500±30740 CFU/孔（p=0.0351）, M.bovis则下降到31000+1000 CFU/孔（p=0.0234）。当外源添加L-NMMA后,胞内菌的数量则上升。因为L-NMMA抑制了NO的生成,由此提示NO的水平与细菌的复制能力存在反比关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 结核病概况
• 1.2 结核分枝杆菌的持续感染机制
• 1.3 精氨酸代谢及一氧化氮的免疫调节作用
• 1.3.1 精氨酸代谢及NO的生物学特性
• 1.3.2 一氧化氮合酶（NOS）及精氨酸酶
• 1.3.3 细胞因子与iNOS和阳离子氨基酸转运蛋白（CAT-2B）的作用
• 1.3.4 NO在分枝杆菌致病机理方面的免疫调节作用
• 1.4 树突状细胞与免疫调节
• 1.4.1 树突状细胞（DCs）的功能及分类
• 1.4.2 NO与树突状细胞（DCs）
• 1.4.3 树突状细胞（DCs）与机体免疫
• 1.5 细胞凋亡的概念及主要信号通路
• 1.5.1 细胞凋亡的概念及其检测方法
• 1.5.2 细胞凋亡的调控基因及主要信号转导途径
• 1.5.3 NO对细胞凋亡的双重作用机制
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 培养基及主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 实验菌种及实验动物
• 3.1.4 荧光定量PCR引物
• 3.1.5 数据统计分析
• 3.2 方法
• 3.2.1 标准菌株的培养与计数
• 3.2.2 小鼠树突状细胞（DCs）的培养与鉴定
• 3.2.3 不同毒力牛分枝杆菌感染小鼠树突状细胞
• 3.2.4 样品收集及RNA提取
• 3.2.5 反转录cDNA第一链的合成
• 3.2.6 荧光定量PCR
• 3.2.7 NO的检测
• 3.2.8 尿素含量的检测
• 3.2.9 小鼠树突状细胞线粒体的提取及细胞色素C的检测
• 3.2.10 树突状细胞电镜样品的制备
• 3.2.11 小鼠树突状细胞凋亡的检测（PI单染法—亚‘G1’峰检测法）
• 3.2.12 胞内菌计数
• 4 结果
• 4.1 小鼠树突状细胞分化与纯度检测
• 4.2 定量PCR的引物验证
• 4.3 精氨酸代谢通路相关基因的转录水平检测
• 4.3.1 Slc7A1基因的相对转录水平
• 4.3.2 Slc7A2基因的相对转录水平
• 4.3.3 iNOS基因的相对转录水平
• 4.3.4 精氨酸酶的相对转录水平
• 4.4 NO浓度检测
• 4.5 尿素浓度检测
• 4.6 细胞色素C的释放实验及树突状细胞电镜的观察
• 4.7 细胞凋亡检测
• 4.8 细菌胞内存活检测
• 5 讨论
• 5.1 不同毒力分枝杆菌感染树突状细胞后L-精氨酸主要代谢酶转录水平的差异分析
• 5.2 小鼠树突状细胞中精氨酸的表达
• 5.3 NO在树突状细胞凋亡通路中的作用
• 5.4 NO在牛分枝杆菌持续感染方面的作用
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢