苹果梨杂交后代单株的RAPD分析

论文摘要

本研究以红金秋、延光梨等6个梨属及红金秋×苹果梨（论文中将供试用的红金秋×苹果梨杂交单株21株简称为1号～21号）的F1代杂种群体21株为试材，应用RAPD技术，对其进行了品种鉴定和分类地位的研究。结果表明：采用改良CTAB法在提取部分梨基因组DNA过程中表现最好且纯度最高；SDS-CTAB法存在大量的降解片段，DNA的获得率不高；经显著性方差分析，采用改良SDS法提取的各梨品种DNA产率均显著优于其他方法，但纯度较低；高盐低pH值法产率和纯度均最低且完整性均不理想。本实验最终采用CTAB改良法快速提取到了较高质量苹果梨杂交后代基因组总DNA用于RAPD扩增，并在RAPD反应中筛选出17个10碱基随机引物，它们的多态性百分率大多在76.07％以上。确定了RAPD-PCR苹果梨杂交后代最适反应体系为：总反应体系为25ul，其中模板DNA浓度为135ng／μL，引物浓度为15pmol，dNTP浓度为1.5mol／L，Mg2+浓度为1.5 mmol／L及Taq DNA聚合酶浓度为1.0 U，其余用重蒸馏水补充。扩增程序为：预变性94℃5min，变性94℃1min，退火温度40℃1min，延伸72℃1.5min，共40个循环；72℃最终延伸5min。建立了27个样品的指纹图谱。找到了4个样品的特征标记。27个样品中的20个样品可以用一个引物的两条带和其它样品区分开。对供试苹果梨杂交后代及其相关品种27株进行了RAPD扩增，根据遗传距离进行了聚类分析，以遗传距离0.30为结合线，将供试样品分成了5类。27个样品的遗传距离范围在0.10～0.46之间，以遗传距离0.30为结合线，将供试样品分成了5类：第一类全部是苹果梨杂交后代，包括：红×苹2号、3号、5～21号，共19个单株；第二类包括红金秋、红×苹1号、4号、苹果梨，说明红×苹1号和4号与苹果梨亲缘关系最近，继承苹果梨的基因较多，其他杂交后代继承红金秋的基因较多；红金秋是大香水和苹果梨的杂交后代，从图11中看出红金秋与苹果梨关系较近，说明红金秋本身遗传了更多的苹果梨的基因；第三类是大香水；第四类是小香水；第五类包括延光梨和东宁5号梨。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 插图和附表清单
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 基因组总DNA提取
• 1.2.1.1 改良CTAB法
• 1.2.1.2 改良SDS法
• 1.2.1.3 SDS-CTAB提取法
• 1.2.1.4 高盐低pH值法
• 1.2.2 基因组DNA检测
• 1.2.2.1 紫外分光光度计检测法
• 1.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测
• 1.2.3 DNA浓度测定及定量稀释
• 1.2.4 RAPD分析
• 1.2.5 引物筛选
• 1.2.6 数据处理及分析
• 2 结果与分析
• 2.1 苹果梨杂交后代及相关品种叶片的形态学观察比较
• 2.2 不同提取方法对梨品种基因组DNA提取效果的影响
• 2.2.1 不同提取方法对梨品种基因组DNA提取中表现差异的比较
• 2.2.1.1 改良CTAB法提取梨DNA过程中表现的差异
• 2.2.1.2 改良SDS法提取梨DNA过程中表现的差异
• 2.2.1.3 SDS-CTAB法提取梨DNA过程中表现的差异
• 2.2.1.4 高盐低pH值法提取梨DNA过程中表现的差异
• 2.2.2 基因组DNA检测
• 2.2.2.1 紫外分光光度计检测
• 2.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.3 苹果梨杂交后代RAPD反应体系优化
• 2.3.1 模板DNA浓度对RAPD扩增效果的影响
• 2.3.2 引物浓度对RAPD扩增效果的影响
• 2.3.3 dNTP浓度对RAPD扩增效果的影响
• 2.3.4 Tag DNA聚合酶浓度对RAPD扩增的影响
• 2浓度对RAPD扩增的影响'>2.3.5 MgCl₂浓度对RAPD扩增的影响
• 2.3.6 扩增反应程序退火温度对RAPD扩增影响的比较
• 2.4 引物的筛选
• 2.5 扩增结果的RAPD图谱分析
• 2.6 苹果梨杂交后代品种的鉴别与特征RAPD标记的选拔
• 2.7 27个苹果梨杂交后代及相关梨品种UPGMA聚类分析
• 3.讨论
• 3.1 DNA的提取
• 3.2 RAPD反应条件的建立及应注意的问题
• 3.3 RAPD在苹果梨杂交后代及相关品种鉴定中的应用
• 4.结论
• 致谢
• 参考文献