淹水胁迫下水稻胚芽鞘中激素代谢相关酶基因的表达及其RNAi载体的构建

论文摘要

在水稻的长期进化过程中,其已经演化出一套适应淹涝胁迫的机制和策略。为进一步从分子水平上研究其耐淹机制,改良其他植物基因,增强抗逆性能,提高作物产量打下理论基础,本实验对淹水胁迫下水稻胚芽鞘快速生长情况,激素代谢相关酶基因的差异表达及激素合成或降解关键酶基因中表达量上调的基因进行RNAi表达载体的构建,拟从生理和分子水平对淹水条件下日本晴胚芽鞘的快速生长机制进行研究,研究结果表明：1.淹水胁迫使得水稻胚芽鞘快速生长对比空气和淹水环境中的胚芽鞘长度,我们发现淹水胁迫下,日本晴胚芽鞘能快速生长。培养后第二天,空气和淹水两种环境中生长的胚芽鞘长度就达到了极显著性差异,培养后第四天,第五天和第六天的结果显示,淹水环境中的胚芽鞘长度都极显著性大于空气中的芽鞘。2.淹水胁迫对日本晴胚芽鞘细胞结构的影响对在黑暗条件下,25℃培养的日本晴培养4天后,将胚芽鞘剥离出来,制成石蜡切片,以观察胚芽鞘的纵切细胞结构与横切细胞结构。结果表明,在纵切细胞结构中,相比较空气组而言,淹水胁迫下,其芽鞘细胞有伸长现象,而在横切结构中,相比较空组,在淹水胁迫下,其细胞面积有所减小,芽鞘细胞的快速伸长与细胞面积的减小使得芽鞘在淹水胁迫下得以在短时间内迅速伸长生长,以适应淹水的逆境环境。3.淹水胁迫下日本晴胚芽鞘内激素合成或降解关键酶基因的表达以β-actin为参照基因,采用RT-PCR技术,研究淹水胁迫对日本晴胚芽鞘内乙烯（ETH）,细胞分裂素（ZT）,脱落酸（ABA）在合成或降解过程中关键酶基因表达的影响。结果表明,淹水胁迫下,ETH合成过程中关键酶ACS基因家族中ACS-1表达量减少,ACS-2,ACS-3表达量增加；ACO基因家族中ACO-1,ACO-2, ACO-3表达量减少,ACO-4, ACO-5,ACO-6表达量增加；ZT合成过程中关键酶IPT基因家族中,IPT-2表达量减少,IPT-1表达量增加；ABA降解过程中关键酶,即8’-羟化酶,表达量增加。4.实时荧光定量PCR检测ACS-2,ACO-6,ABA降解关键酶—8’-羟化酶基因的相对表达差异以β-actin为参照基因,采用荧光实时定量PCR技术比较ACS-2, ACO-6,8’-羟化酶基因在空气和淹水条件下培养4、5、6天后的相对表达差异。结果表明,ACS-2基因在淹水4、5天后分别有857.92倍、873.16倍的过量表达,但在淹水6天后没有过量表达；ACO-6基因在淹水4、5天后分别有201.86倍、327.01倍的过量表达,但在淹水6天后也没有过量表达；8’-羟化酶基因在淹水4、5天后分别有59.39倍、1.17倍的过量表达,在淹水6天后有1.52倍的过量表达。由此推断ACS-2,ACO-6,8’-羟化酶基因均可能与淹水刺激水稻胚芽鞘的快速生长密切相关。5.RNAi表达载体的构建应用PCR反扩与MAGIC的相关实验技术构建ACS-2, ACO-4, ACO-6,8’-羟化酶基因的RNAi表达载体,PCR电泳检测及测序结果表明,RNAi表达载体构建成功。6.RNAi双元表达载体的构建将（?）RNAi表达载体质粒进行农杆菌的介导转化,以制备ACO-6基因的RNAi双元元表达载体,由PCR及双酶切鉴定可知,RNAi双元表达载体构建成功。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 淹水胁迫对植物的影响
• 1.2 淹水胁迫对水稻生长的影响
• 1.2.1 生长状态
• 1.2.2 水稻耐淹机理的相关研究进展
• 1.3 植物激素在植物适应耐淹机制中的作用
• 1.3.1 乙烯在植物适应耐淹机制中起主导作用
• 1.3.2 乙烯合成过程中的关键酶
• 1.3.3 乙烯合成中ACS基因和ACO基因表达的研究
• 1.3.4 细胞分裂素合成过程中的关键酶
• 1.3.5 ABA降解过程中的关键酶
• 1.4 实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）技术
• 1.4.1 实时荧光定量PCR技术原理
• 1.4.2 实时荧光定量PCR中非特异性扩增与特异性扩增的检测
• 1.4.3 定量方法
• 1.4.4 实时荧光定量PCR技术的应用
• 1.5 RNA干扰
• 1.5.1 RNA干扰的作用机制
• 1.5.2 siRNA研究进展
• 1.5.3 常用制备siRNA的方法
• 1.5.4 miRNA的研究进展
• 1.5.5 siRNA与miRNA的区别
• 1.6 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 试剂盒
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 溶液
• 2.1.7 培养基
• 2.1.8 实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 空气和淹水环境中水稻胚芽鞘的培养
• 2.2.2 石蜡切片制作水稻胚芽鞘细胞结构
• 2.2.3 水稻胚芽鞘总RNA提取至转录为cDNA过程
• 2.2.4 RT-PCR检测不同培养条件下胚芽鞘中ACS基因家族,ACO基因家族,IPT基因家族,8’-羟化酶的表达差异
• 2.2.5 实时荧光定量PCR检测不同培养条件下胚芽鞘中ACS-2,ACO-6,8’-羟化酶的相对表达差异
• 2.2.6 RNAi载体图谱及构建流程
• 2.2.7 感受态细胞DH-10β的制备
• 2.2.8 乙烯合成关键酶基因,ABA降解关键酶基因的RNAi表达载体构建
• 2.2.9 RNAi双元表达载体的构建
• 第三章 结果与分析
• 3.1 黑暗条件下,持续淹水胁迫对胚芽鞘生长速度的影响
• 3.2 持续淹水胁迫对胚芽鞘细胞结构的影响
• 3.3 日本晴胚芽鞘总RNA提取
• 3.4 RT-PCR检测不同培养条件下胚芽鞘中ACS基因家族,ACO基因家族,IPT基因家族,8’-羟化酶的表达差异
• 3.5 实时荧光定量PCR检测不同培养条件下胚芽鞘中ACS-2,ACO-6,8’-羟化酶的相对表达差异
• 3.5.1 PCR产物熔解曲线和扩增效率一致性分析
• 3.5.2 基因相对表达差异的比较
• 3.6 RNAi表达载体的构建
• 3.6.1 PCR反扩
• 3.6.2 RNAi中间载体质粒抽提
• 3.6.3 质粒PCR检测
• 3.6.4 MAGIC,构建RNAi表达载体
• 3.7 含RNAi的双元表达载体的鉴定
• 3.7.1 植物双元表达载体的PCR鉴定
• 3.7.2 双酶切鉴定
• 第四章 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢