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流式DNA倍体及CYFRA21-1在膀胱癌的临床应用研究

2020-12-02阅读(94)

流式DNA倍体及CYFRA21-1在膀胱癌的临床应用研究

论文摘要

膀胱癌是目前我国泌尿系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤,早期诊断和术后定期复查对该病的治疗至关重要。膀胱镜检查是诊断膀胱移行细胞癌的最准确方法,因系创伤性检查,尚有一些禁忌症,其临床应用有时受到限制。最常用的非创伤性检查方法是尿细胞学检查,其敏感性一般在20%-70%之间,且受肿瘤分级和检查者经验的主观影响。另外,一些新的尿液肿瘤标记物相继出现并应用于临床,虽优于尿细胞学检查,但其敏感性和特异性尚需进一步提高和完善。因此寻找无创伤性的,更客观方便和高敏感性、高特异性的尿液肿瘤标志物具有重要临床意义。虽然有文献报道尿脱落细胞DNA倍体分析可望成为诊断膀胱癌的一种辅助方法,但由于缺乏流式DNA倍体定量检测的标准方法,限制了该方法的应用。本文建立了流式DNA倍体分析的标准方法,探讨其临床应用价值。此外,本文运用新一代国际先进的电化学发光免疫标记技术检测尿液脱落细胞CYFRA21-1含量具有高敏感性和特异性特点;应用SYBR Green荧光染料和18SrRNA看家基因建立荧光实时定量RT-PCR方法检测膀胱癌尿液脱落细胞CYFRA21-1基因mRNA,为膀胱癌早期诊断提供新思路。有关运用荧光实时定量RT-PCR技术检测膀胱癌尿液脱落细胞CYFRA21-1基因的表达及探讨膀胱癌尿液脱落细胞DNA倍体和CYFRA21-1蛋白浓度变化的关系尚未见相关文献报道。本文的另一创新点是从肿瘤生物学行为整体和发展变化的角度联合流式DNA倍体和CYFRA21-1肿瘤标志物的选择。探讨尿液脱落细胞DNA倍体和CYFRA21-1在膀胱肿瘤的临床应用价值。本文研究结果表明:膀胱癌组、急性尿道感染及腺性膀胱炎组和对照组之间,尿流式DNA倍体分析中DI（DNA指数）、SPF（S期细胞峰百分比）、PI（增殖指数）、G0/G1期CV值和CYFRA21-1蛋白含量存在显著差异（P＜0.05）,说明尿液脱落细胞DI、SPF、PI、G0/G1期CV值和CYFRA21-1蛋白可作为膀胱癌辅助诊断指标。膀胱癌组尿液脱落细胞DI、PI、SPF、G0/G1期CV值及CYFRA21-1蛋白含量在性别上的差异无统计学意义（P＞0.05）;随着膀胱癌病理分级和临床分期的增加,DI、SPF和CYFRA21-1蛋白含量相应逐渐增加,病理分级为Ⅲ级、Ⅳ级膀胱癌患者DI显著高于Ⅰ级和Ⅱ级患者（P＞0.05）;临床分期T4期膀胱癌患者PI和CYFRA21-1蛋白含量显著高于Ta期、T1期、T2期、T3期患者（P＜0.05）。说明膀胱脱落细胞DNA倍体和CYFRA21-1蛋白浓度的变化与膀胱癌的恶性程度相关。临床分期为Ta期的膀胱癌组异倍体率是20%,T1-T4期膀胱癌组异倍体率是62.5%,差异具有显著性意义（P＜0.05）。反映浸润型膀胱癌异倍体率显著高于浅表型膀胱癌（P＜0.05）。说明膀胱癌尿液流式DNA异倍体率与膀胱癌病变发展相关。SPF＞15%作为膀胱肿瘤恶性的判断标准,研究结果发现膀胱癌不同病理分级及临床分期尿液脱落细胞SPF＞15%的患者阳性率相差不大,但膀胱癌组SPF＞15%的患者阳性率显著高于对照组,可作为膀胱癌发生的辅助判断指标之一。以细胞G0/G1期CV＞10%作为膀胱肿瘤恶性的判断标准,研究结果发现膀胱癌不同病理分级及临床分期尿液脱落细胞G0/G1期CV＞10%的患者阳性率相差不大,但膀胱癌组CV＞10%的患者阳性率显著高于对照组,可作为膀胱癌发生的辅助判断指标之一。原发性膀胱癌和复发性膀胱癌患者尿液脱落细胞DI、PI、SPF、G0/G1期CV值及CYFRA21-1蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05）,说明尿液流式DNA倍体分析和CYFRA21-1蛋白含量可能不适合预示膀胱癌复发。膀胱癌尿液细胞DNA倍体中DI、PI、SPF、G0/G1期CV值和CYFRA21-1蛋白相关性分析,发现尿液脱落细胞DNA分析中DI和G0/G1期CV值与CYFRA21-1蛋白含量在膀胱癌的辅助诊断评价具有相关性。联合检测尿液流式DNA倍体和CYFRA21-1蛋白的敏感性和特异性与单指标检测的敏感性和特异性比较,差异具有显著性意义（P＜0.05）,说明联合流式DNA倍体和CYFRA21-1蛋白辅助诊断膀胱癌的敏感性和特异性显著提高,具有重要临床应用价值。采用荧光实时定量RT-PCR技术检测膀胱癌及癌旁组织中CYFRA21-1基因mRNA的表达情况,结果发现在膀胱癌组织中的CYFRA21-1基因mRNA表达高于在癌旁组织中的表达,提示CYFRA21-1与膀胱癌的发生有关,可作为膀胱癌的一个新的肿瘤标记物。采用荧光实时定量RT-PCR技术检测膀胱癌患者尿液脱落细胞CYFRA21-1基因mRNA的转录水平,发现膀胱癌尿液脱落细胞CYFRA21-1基因mRNA水平与CYFRA21-1蛋白质表达变化趋势一致;同时,在不同病理分化程度的患者尿液中,病理分化程度越差。CYFRA21-1基因mRNA转录水平越高。尿液流式DNA倍体及CYFRA21-1表达异常与膀胱癌生物学行为相关,联合检测尿液流式DNA倍体和CYFRA21-1可以提高膀胱癌辅助诊断的敏感性,是监测膀胱癌疗效的无创性的良好指标。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  • 第一节 DNA倍体在肿瘤临床应用进展
  • 1 DNA倍体在泌尿系统肿瘤的临床应用进展
  • 1.1 DNA倍体在膀胱肿瘤临床应用进展
  • 1.2 DNA倍体在肾脏肿瘤的临床应用进展
  • 1.3 DNA倍体在前列腺肿瘤的临床应用进展
  • 2 DNA倍体在妇科肿瘤的临床应用进展
  • 3 DNA倍体在头颈部肿瘤的临床应用进展
  • 第二节 CYFRA21-1在肿瘤临床应用进展
  • 1 CYFRA21-1在泌尿系统肿瘤的临床应用进展
  • 1.1 CYFRA21-1在膀胱肿瘤临床应用进展
  • 1.2 CYFRA21-1在其它泌尿系统肿瘤的临床应用进展
  • 2 CYFRA21-1在妇科肿瘤的临床应用进展
  • 3 CYFRA21-1在头颈部肿瘤的临床应用进展
  • 4 CYFRA21-1在肺癌的临床应用进展
  • 第三节 分析技术研究进展
  • 1 流式细胞术分析DNA倍体
  • 2 电化学发光免疫分析法分析CYFRA21-1
  • 3 荧光定量RT-PCR法分析CYFRA21-1
  • 第四节 本文研究内容和科学意义
  • 第二章 材料与方法
  • 一 实验材料
  • 1 标本的收集
  • 2 实验仪器设备
  • 3 主要试剂
  • 3.1 流式DNA分析试剂
  • 3.2 CYFRA21-1电化学发光分析试剂
  • 3.3 CYFRA21-1荧光定量PCR分析试剂
  • 3.3.1 RNA提取试剂盒（飞捷生物公司"RNAfast1000"产品）
  • 3.3.2 cDNA合成试剂盒（美国Promega公司产品）
  • 3.3.3 RT-PCR检测试剂（美国Promega公司产品）
  • 3.3.4 荧光定量PCR检测试剂
  • 3.3.5 引物的设计与合成
  • 3.3.6 18S rRNA primer内对照试剂
  • 3.3.6 琼脂糖电泳试剂
  • 3.4 细胞培养试剂
  • 二 实验方法
  • 1 FCM DNA倍体的分析
  • 1.1 尿液标本的采集
  • 1.2 尿液标本的标准化处理
  • 1.3 荧光抗体标记
  • 1.4 流式细胞仪的标准化检测及分析
  • 2 CYFRA21-1的分析
  • 2.1 尿液标本的采集
  • 2.2 尿液标本的处理
  • 2.3 电化学发光免疫分析仪检测及分析
  • 3 PCR相关实验
  • 3.1 RNA提取实验
  • 3.2 反转录实验
  • 3.3 RT-PCR反应
  • 3.4 FQ-RT-PCR反应
  • 3.4.1 引物分装
  • 3.4.2 荧光定量PCR实验
  • 3.4.3 DNA的琼脂糖电泳
  • 3.4.4 从琼脂糖凝胶中回收DNA
  • 3.4.5 PCR产物纯化
  • 3.4.6 扩增效率的计算
  • 3.4.7 重复性检测
  • 3.4.8 标准曲线的建立
  • 3.4.9 CYFRA21-1mRNA表达水平相对定量分析:
  • 4 细胞相关实验
  • 4.1 膀胱癌T24细胞培养有关试剂的配置
  • 4.1.1 培养基的配置
  • 4.1.2 小牛血清的处理
  • 4.1.3 抗生素的配制
  • 4.1.4 胰酶消化液
  • 4.1.5 1×PBS（pH7.4）的配制
  • 4.2 细胞复苏
  • 4.3 换液
  • 4.4 传代
  • 4.5 细胞保种
  • 4.6 细胞计数
  • 5 敏感性特异性分析
  • 6 统计学分析
  • 第三章 结果与讨论
  • 1 膀胱癌等不同组别尿液流式DNA倍体状况
  • 2 膀胱癌患者尿液流式DNA倍体与膀胱癌病理分级和临床分期的关系
  • 3 流式DNA异倍体率与膀胱癌临床分期的关系
  • 4 流式分析SPF在膀胱癌的辅助诊断价值
  • 0/G1期CV值在膀胱癌的辅助诊断价值'>5 流式分析G0/G1期CV值在膀胱癌的辅助诊断价值
  • 6 膀胱癌患者尿液流式DNA倍体对膀胱癌预后的评估
  • 7 流式DNA倍体分析的敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率、阳性似然比和阴性似然
  • 8 CYFRA21-1含量的变化在膀胱癌辅助诊断价值
  • 9 CYFRA21-1含量与膀胱癌病理分级和临床分期的关系
  • 10 CYFRA21-1含量的变化对膀胱癌预后的评估
  • 11 FQ-RT-PCR方法检测膀胱癌患者组织及尿液中CYFRA21-1含量变化
  • 11.1 RNA的纯度和完整性分析
  • 11.2 FQ-RT-PCR的扩增效率检测
  • 11.3 重复性检测:
  • 11.4 标准曲线的建立
  • 11.5 CYFRA21-1在膀胱组织、细胞T24株和尿液中表达水平分析
  • 12 CYFRA21-1含量检测的敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率、阳性似然比和阴性似然比
  • 13 流式DNA倍体与CYFRA21-1的辅助诊断价值评价
  • 14 流式DNA倍体分析与CYFRA21-1检测的敏感性、特异性临床应用价值
  • 第四章 结论
  • 参考文献
  • 缩略语及中英文对照表
  • 已发表和待发表论文情况
  • 致谢

    • 相关论文文献

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