绿僵菌转化16α、17α-环氧黄体酮的工艺研究

论文摘要

本课题主要实验一种新的16α、17α-环氧黄体酮转化菌种—绿僵菌,先用一般生产上用的直接投底物法进行尝试,并对发酵条件进行优化,发现绿僵菌羟化能力很强,在2%投料浓度下摇瓶转化率可达到70%左右,但在100L发酵罐中放大却达不到期望的转化率,只有40%左右。通过检测溶氧,发现溶解氧很低,在投底物时溶氧浓度只有3%的溶氧饱和度,确定了溶氧是限制绿僵菌转化能力的主要因素。为了改善溶氧,试验了静息细胞转化工艺,通过对转化条件的优化,得到了静息细胞工艺的最优参数,以1%的量接种于摇瓶种子发酵培养基中,28℃,180r/min培养40h左右。再以5%接种量将种子发酵液接种于二级培养基中,发酵条件不变,培养23h左右,过滤120ml发酵液的菌丝,再把菌丝投入100ml缓冲溶液中,温度30℃,180r/min,继续转化30h。发酵结束,转化率60%左右,随后在100L发酵罐中放大,转化率为45%左右。为了解决溶氧问题,先在摇瓶上试验,从减少菌体生物量入手,采用添加抑制剂、减少营养、稀释菌体来解决生物量和转化率问题,发现在接种时添加1%的乙醇,可对生物量有一定的减少作用,并且有促进转化的作用。稀释菌体可有效减少生物量,转化率也下降较少。对稀释菌体进行了优化和补充,形成了稀释补料工艺,工艺参数为1ml孢子悬液接种于100ml（500 ml三角瓶）发酵培养基中,28℃,摇床180r/min,培养48h后,将发酵液按1:1量添加无菌水稀释发酵液,然后加入2%底物,氧化8h、20h分别加入0.5%葡萄糖,氧化34h加入0.5%葡萄糖和0.05%氨水,氧化64h升温出料,生物量保持在10-15 g/l,在摇瓶中的转化率可达到72%左右。随后在100L发酵罐中放大,转化率为53%左右。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 甾体药物的发现
• 1.1.1 甾体药物介绍
• 1.1.2 性甾体药物的发现
• 1.1.3 肾上腺皮质甾体药物的发现
• 1.2 微生物转化甾体的发展历史
• 1.2.1 生物转化甾体的发现
• 1.2.2 生物转化甾体技术的发展
• 1.2.3 生物转化甾体技术的机理
• 1.2.4 C11α-羟化酶
• 1.2.5 C11β-羟化酶
• 1.2.6 脱氢酶
• 1.3 微生物转化甾体的一般工艺
• 1.4 微生物转化甾体的影响因素
• 1.4.1 溶氧的影响
• 1.4.2 培养基组成的影响
• 1.4.3 底物物理状态对转化率的影响
• 1.4.4 预诱导剂加入对转化率的影响
• 1.5 绿僵菌的分类和特性
• 1.5.1 绿僵菌的分类
• 1.5.2 绿僵菌的营养条件
• 1.6 研究意义
• 2 直接投底物转化法的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验菌种
• 2.1.4 斜面与摇瓶培养基
• 2.1.5 摇瓶培养条件
• 2.1.6 发酵罐培养条件
• 2.1.7 菌体干重测定
• 2.1.8 提取及转化率分析方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 初始培养基pH值对转化率的影响
• 2.2.2 培养温度对转化率的影响
• 2.2.3 投底物时间对转化率的影响
• 2.2.4 投底物量对转化率的影响
• 2.2.5 转速对转化率的影响
• 2.2.6 溶料方式对转化率的影响
• 2.2.7 100L发酵罐放大试验
• 2.2.8 转速与通气量对溶解氧的影响
• 2.2.9 菌丝形态和底物转化晶体形态
• 2.3 小结
• 3 细胞静息工艺
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 试验仪器
• 3.1.2 试验试剂
• 3.1.3 菌种和底物
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 摇瓶培养条件
• 3.1.6 发酵罐培养条件
• 3.1.7 菌体干重测定
• 3.1.8 提取及转化率分析方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 缓冲体系对转化率的影响
• 3.2.2 菌丝培养时间对转化率的影响
• 3.2.3 缓冲体系pH对转化率的影响
• 3.2.4 温度对转化率的影响
• 3.2.5 菌丝投入量对转化率的影响
• 3.2.6 转化终点的选择
• 3.2.7 100L发酵罐放大试验
• 3.3 小结
• 4 减少菌体量与稀释补料工艺研究
• 4.1 试验材料和方法
• 4.1.1 试验仪器
• 4.1.2 试验试剂
• 4.1.3 菌种和底物
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 摇瓶培养条件
• 4.1.6 发酵罐培养条件
• 4.1.7 菌体干重测定
• 4.1.8 提取及转化率分析方法
• 4.1.9 还原糖测定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 投底物时间对生物量和转化率的影响
• 4.2.2 添加有机溶剂对生物量和转化率的影响
• 4.2.3 不同氮源对生物量和转化率的影响
• 4.2.4 培养基稀释对生物量和转化率的影响
• 4.2.5 菌体稀释对生物量和转化率的影响
• 4.2.6 菌体稀释并补料对生物量和转化率的影响
• 4.2.7 菌体稀释补料工艺100L发酵罐实验
• 4.2.8 稀释补料工艺与直接投底物和静息细胞工艺的比较
• 4.3 小结
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.1.1 直接投底物工艺
• 5.1.2 静息细胞工艺
• 5.1.3 对生物量的影响因素
• 5.1.4 稀释补料工艺
• 5.2 讨论
• 5.2.1 溶氧提高问题
• 5.2.2 菌丝损伤问题
• 5.2.3 细胞色素P450酶的测定
• 参考文献
• 英文摘要
• 攻读硕士期间发表论文