金属硫蛋白突变体的构建、表达及工程菌对重金属的吸附

论文摘要

本文以猴金属硫蛋白（mMT）为研究对象，采用PCR技术和同尾酶手段，构建了mMT的突变体，获得了金属硫蛋白α域单体（MTα）及二聚串连体（MTα2）、三聚串连体（MTα3）、四聚串连体（MTα4）、五聚串连体（MTα5）。表达并纯化了MTα，测定了表达多聚串连体的工程菌抗镉能力，以及镉、锌吸附能力。主要结果如下：1．构建了mMTα域表达载体，并用其转化大肠杆菌BL2l（DE3），表达、纯化后获得高纯度的MTα，其镉结合能力与理论值一致。2．结构预测显示，MTα、MTα2、MTα3的二级结构中，α螺旋依次增加，推测突变蛋白的疏水性增强，蛋白质三维结构稳定。MTα4、MTα5二级结构中，α螺旋数目减少，尤其是MTα5，其α螺旋几乎完全遭到破坏，疏水性大为降低，这可能造成蛋白质空间结构的不稳定性。3．构建了表达mMTα域多聚串连体的工程菌，获得了表达二聚串连体（MTα2）、三聚串连体（MTα3）、五聚串连体（MTα5）的工程菌（MTα2／BL21、MTα3／BL21、MTα5／BL21）。4．0.5 mmol／L Cd2+时，对照菌生长受到严重胁迫，工程菌表现出一定的抗性，对MTαn／BL21，（n=2，3，5）生长几乎没有胁迫。1.0 mmol／L Cd2+时候，MTα5／BL21表现出较强耐受能力。5．在低浓度Cd2+（0.067 mmol／L）时，表达有野生型猴金属硫蛋白的工程菌（MT／BL21）表现出较高的镉吸附能力（0.0615 mmol／mg细胞干重），随着镉浓度的升高，这种趋势更加明显，在镉浓度为0.268 mmol／L时，MT／BL21镉吸附量为0.093mmol／mg细胞干重，是对照（pGEX-2T／BL21）的2.5倍。0.5 mmol／L Cd2+时，工程菌对镉的清除能力明显高于对照，其中清除能力最强的是MTα3／BL21（76％），其次是MTα2／BL21（72％）。6．MT／BL21对锌吸附能力显著提高（0.118 mmol／mg细胞干重），而转化有MTα串连突变体基因的工程菌对锌的吸附能力没有明显提高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 环境重金属污染的微生物修复
• 1.1.1 目的菌
• 1.1.2 靶蛋白
• 1.1.3 工程菌构建策略
• 1.2 金属硫蛋白及其突变体
• 1.2.1 MT的定义和基本特性
• 1.2.2 MT的分类
• 1.2.3 MT的性质
• 1.2.4 MT的功能
• 1.2.5 MT的结构
• 1.2.6 MT金属结合特性及其突变体
• 1.2.7 串连多聚体构建
• 1.3 研究目的及意义
• 2. 金属硫蛋白A域（MTA）原核表达克隆的构建、表达及纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株与质粒
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 MTα基因序列的设计及克隆
• 2.2.2 MTα基因片段的TA克隆及回收
• 2.2.3 原核表达载体pGEX-2T的酶切、去磷酸化处理及酶连检测
• 2.2.4 pGEX-2T与MTα基因的连接及阳性重组子的筛选
• 2.2.5 MTα基因在E. coli JM109与E. coli BL21体内表达效率对比
• 2.2.6 不同浓度IPTG诱导表达情况对比
• 2.2.7 菌体收获时间的确定
• 2.2.8 不含镉的融合蛋白少量表达
• 2.2.9 MTα-Cd的分离、活性测定及MTα结构预测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 MTα基因序列的设计及克隆结果
• 2.3.2 pTA2-MTα的鉴定与MTα基因片段的回收结果
• 2.3.3 pGEX-2T的酶切及去磷酸化结果
• 2.3.4 pGEX-MTα的获得情况
• 2.3.5 MTα在E.coli JM109与E.coli BL21内表达效率对比
• 2.3.6 不同浓度IPTG诱导表达情况对比
• 2.3.7 菌体收获时间确定
• 2.3.8 不含镉的融合蛋白的少量制备
• 2.3.9 GST-MTα融合蛋白纯化结果及活性测定及结构预测
• 3 MTA基因串连体的构建及工程菌的重金属吸附
• 3.1 实验材料与菌株
• 3.2 工程菌构建及其重金属吸附量测定
• 3.2.1 MTα串连体的构建
• 3.2.2 相关序列
• 3.2.3 MTα基因串连体的获得
• 3.2.4 工程菌构建
• 3.2.5 工程菌的镉抗性测定
• 3.2.6 工程菌对镉吸附量的测定
• 3.2.7 工程菌对锌吸附量的测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 MTα基因串连体
• 3.3.2 生物信息学方法分析突变蛋白质结构
• 3.3.3 工程菌对镉的抗性
• 3.3.4 工程菌对镉的吸附量
• 3.3.5 工程菌对锌的吸附量
• 4. 结论
• 5. 参考文献
• 6. 附录
• 致谢