论文摘要
作为最重要的抑癌基因之一,p53通过影响编码细胞周期相关蛋白质基因的表达来调控细胞周期的G1和G2/M期阻滞, DNA损伤严重不能修复,则诱导细胞发生凋亡。p53抑癌功能丧失的主要方式是基因突变,但有50%的肿瘤具有野生型p53,这些表达野生型p53的肿瘤中p53蛋白失活的机制多年来一直困扰着人们。最近p53凋亡刺激蛋白（ASPP）家族的发现为解决这一难题开辟了新的思路。目的:通过观察比较不同浓度的多种化疗药物处理肿瘤细胞株A549和A375p前后ASPP2和iASPP表达的变化,探讨ASPP家族蛋白表达状态在调控肿瘤细胞的化疗反应性,特别是DNA损伤性化疗药物诱导的细胞凋亡过程中的作用。方法:MTT法筛选三种药物（顺铂,CDDP;吡柔比星,THP;β-榄香烯,β-Ele）的最小有效浓度,初步检测各药物对A549和A375p细胞的生长抑制情况;用MTT法筛选出的最小有效浓度处理两种细胞,24小时后流式细胞仪（FCM）检测各组细胞的凋亡率,同时辅以透射电镜观察各处理组细胞的形态变化;免疫荧光观察药物处理前后iASPP的表达变化;RT-PCR测定不同处理组ASPP2基因mRNA的表达。实验数据用SPSS统计软件处理,均数比较用方差分析（ANOVA）,非参数比较用Wilcoxon秩和检验,P<0.05认为有统计学意义。结果:各处理组MTT检测结果显示:CDDP和β-Ele对A549和A375p细胞的生长抑制作用均有良好的剂量和时间依赖性,THP的剂量依赖性不明显。FCM测定不同处理组细胞凋亡情况显示,3.0μg/ml的CDDP、1.25μmol/l的THP和50.0μg/ml的β-Ele分别处理两种细胞,24小时后,各处理组均有凋亡峰出现,CDDP、THP和β-Ele各组与对照组均有显著差别（P<0.01）,CDDP和THP处理组不同细胞间差别显著,CDDP处理组A549细胞凋亡较A375p细胞明显（P<0.01）,而THP和β-Ele处理组A549细胞凋亡不如A375p细胞明显（P<0.01;P<0.05）;透射电镜下观察,未经药物处理的肿瘤细胞核圆、形态规则,核仁清晰,染色质分布均匀,细胞膜完整;经药物作用后各组均可见凋亡细胞,核膜皱缩内陷不规则,染色质边集,呈新月状分布于核膜下;THP组可见染色质浓缩、边集明显,并伴有典型凋亡小体形成,同时可见有少量坏死细胞。免疫荧光显示,未加药物处理的A549和A375p细胞胞质染色均匀呈亮绿色,核区较暗;CDDP及β-Ele处理组细胞为暗绿色,其中可见皱缩的凋亡细胞;THP处理的细胞胞质荧光弱呈灰绿色,由于THP嵌入DNA自发红色荧光与二抗的绿色荧光中和,胞核被染成桔红色,结果提示药物处理后A549和A375p细胞中iASPP的表达有不同程度的下降。对ASPP2基因mRNA的RT-PCR产物分析表明,CDDP和THP处理A549和A375p细胞后ASPP2表达量增加（P=0.029,P=0.001;P=0.047,P<0.001）,ASPP2的相对表达量改变在两种细胞中差异不显著（P=0.876,P=0.25）;β-Ele处理后,A375p细胞中ASPP2的表达量增加（P=0.01）,但A549细胞中ASPP2的表达量改变不明显（P=0.185）。结论:本实验选取两种表达野生型p53的肿瘤细胞株A549和A375p,不同药物处理后,结合多种方法对ASPP家族的表达进行检测,根据实验结果作出结论如下:CDDP、THP和β-Ele对两种表达野生型p53的肿瘤细胞株A549和A375p的生长都有明显的抑制作用,CDDP和THP都可诱导A549和A375p凋亡。未处理的A549和A375P均表达ASPP2和iASPP基因,表达量差异不明显;CDDP和THP处理后ASPP2表达上调,而iASPP的表达下调,提示ASPP家族表达的变化是CDDP和THP抗肿瘤效应的机制之一。