土壤中多功能木霉菌的筛选鉴定及木霉多样性分析

论文摘要

木霉是土壤微生物区系的重要组成部分,在土壤中增加其含量能够防治多种植物病害,是应用非常广泛的生物防治菌。分析土壤中木霉的遗传以及功能多样性,能够为开发多功能木霉资源,拓展木霉的应用空间,有效地利用木霉防治植物病原菌,提供理论基础,并可能发现能够应用于多功能菌剂开发的木霉菌株。本实验从山东省临沂、聊城、寿光、章丘四个地区的西红柿、黄瓜大棚,韭菜、白菜菜地,大蒜、大葱种植区采取的120份土壤样品中分离获得木霉244株。通过对峙培养实验发现对棉花棉花立枯丝核菌具有一定拮抗功能的有114株,其中拮抗作用较好的有19株;通过固体培养法检测解磷、解钾、固氮能力发现,244株木霉中有74株具有明显解磷圈,且发现拮抗效果较好的19株解磷圈较大,未发现有明显解钾透明圈的菌株,所有菌株在固氮培养基上无生长现象。对19株拮抗效果较好且解磷圈较大的菌株进行液体培养检测解磷、解钾能力,发现,在液体培养条件下,部分菌株未显示出解磷能力,菌株T13-8（1.792μg/mL）、T23（1.652μg/mL）显示出较高的解磷能力;部分菌株在液体培养下显示出一定的解钾功能,菌株T47-4（20.585μg/mL）显示出较高的解钾能力。通过平板实验检测此19个菌株植酸酶活性发现,能够水解植酸钙的有15株,其中包括高效解磷菌株T13-8、T23,高效解钾菌株T47-4。对以上19个菌株进行了形态学和分子生物学鉴定,发现菌株T8-4、T9-1、T23、T25、T30-5、T31-3、T38-5、T47-4、T35-1为Trichoderma longibrachiatum;菌株T80-2、T38-6、T13-8、T44-1、T57、T62-2、T34、T17为Trichodermaharzianum;菌株T61-2为Trichoderma virens;菌株T18-1为Trichodermacitrinoviride。依据ITS序列进行的系统发育分析结果支持此19个木霉菌株的鉴定结果。研究土壤木霉多样性时,将来自相同地区同种蔬菜作物的土样混合为一份土样,120份共混成13份混合土壤样品,设计木霉ITS区特异保守序列扩增引物,利用PCR-DGGE技术对土壤木霉的多样性进行了分析。发现,临沂地区木霉多样性较高,其次为聊城、寿光、章丘;同一地区,不同蔬菜作物土壤中,木霉种类具有相似性,不同地区之间也有相似种;木霉多样性高的地区土传病害的发生相对较少。为了进一步对PCR-DGGE技术用于土壤木霉多样性分析的可行性提供理论支持,本实验先后通过DGGE技术对19株木霉混合基因组DNA和对应土样基因组DNA的PCR产物、4株单个木霉基因组DNA和相应土样基因组DNA的PCR产物进行了分析,两项研究都证明了DGGE技术应用于土壤木霉多样性分析结果的可靠性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 引言
• 1.1 木霉菌的生长条件、分布及生防研究进展
• 1.1.1 木霉的生长条件及分布
• 1.1.2 木霉菌的生防作用
• 1.2 多功能木霉资源的开发
• 1.2.1 解磷微生物研究进展
• 1.2.2 解钾及固氮微生物研究进展
• 1.3 木霉形态学分类
• 1.3.1 木霉菌属的分组检索表
• 1.3.2 木霉菌属各组的描述
• 1.4 PCR-DGGE方法分析土壤中木霉分子生态学多样性
• 1.4.1 PCR-DGGE技术原理
• 1.4.2 PCR-DGGE方法在土壤微生物分子生态学研究中的应用
• 1.4.3 DGGE技术在土壤木霉多样性分析中的应用
• 1.5 本课题的研究工作及意义
• 1.6 技术路线
• 1.6.1 多功能木霉菌株的筛选
• 1.6.2 DGGE方法分析土壤中木霉多样性
• 第二章 从土壤中分离筛选木霉培养基的研究及菌株分离
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 土样采集
• 2.1.2 木霉分离培养基的选择研究
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 从土壤中分离木霉培养基的选择研究
• 2.2.2 土样的采集及木霉菌分离情况
• 2.3 小结
• 第三章 木霉菌株拮抗作用的初步研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 培养基及菌种
• 3.1.2 平板对峙实验
• 3.1.3 木霉菌生防菌株的指示性状
• 3.1.4 拮抗优势菌株的选取条件
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 木霉对棉花立枯丝核菌拮抗作用各项指标说明
• 3.2.2 拮抗指标观察记录情况
• 3.3 小结
• 第四章 解磷解钾及固氮木霉菌的筛选
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 供试菌株
• 4.1.3 培养基及试剂
• 4.1.4 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 解磷解钾固氮能力固体培养观察结果
• 4.2.2 液体条件下培养结果测定解磷、解钾能力
• 4.2.3 植酸酶活性检测
• 4.3 小结
• 第五章 木霉菌株的鉴定及系统发育学分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 形态学鉴定
• 5.1.2 分子生物学鉴定
• 5.1.3 系统发育学分析
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 形态观察结果
• 5.2.2 分子生物学鉴定结果
• 5.2.3 系统发育树构建
• 5.3 小结
• 第六章 土壤基因组DNA提取方法的研究及基因组提取
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 仪器及主要试剂
• 6.1.2 土壤基因组DNA的提取方法
• 6.1.3 粗DNA提取物的纯化方法
• 6.1.4 通过PCR检测提取基因组DNA的质量
• 6.1.5 混合土壤样品菌群基因组DNA的提取
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 土壤菌群基因组DNA提取研究结果
• 6.2.2 PCR检测结果
• 6.2.3 混合土壤样品微生物菌群基因组DNA提取结果
• 6.3 小结
• 第七章 应用DGGE的方法分析土壤中木霉的多样性
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 仪器
• 7.1.2 供试菌株
• 7.1.3 试剂
• 7.1.4 主要实验技术
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 引物特异性检测
• 7.2.2 巢式PCR扩增结果
• 7.2.3 DGGE-垂直电泳确定变性胶范围
• 7.2.4 DGGE-水平电泳检测土壤中木霉菌多样性
• 7.3 小结
• 第八章 总结
• 参考文献
• 致谢