酵母双杂交系统筛选与Myosin X相互作用的蛋白质

论文摘要

酵母双杂交系统是目前研究蛋白质相互作用的重要手段之一,此方法具有高灵敏度、相对简单、快捷及不经蛋白纯化即可获得蛋白编码区的优点。近年来,酵母双杂交技术在研究蛋白质相互作用、筛选新蛋白、研究蛋白功能等方面发挥了重要作用。肌球蛋白X（Myosin X, Myo X）是仅表达于脊椎动物中的非传统肌球蛋白,其尾部的MyTH4和FERM结构域可与多种功能蛋白相结合。这些蛋白与丝足的形成、神经元的突起生长与投射、内皮细胞的迁移、细胞的粘附及有丝分裂中纺锤体的形成等过程密切相关。因此Myo X在脊椎动物细胞中发挥了重要作用。为了进一步深入的研究Myo X在脊椎动物体内的作用,本研究利用酵母双杂交技术,以Myo X的尾部结构域中的MyTH4和FERM结构为诱饵,对人胎脑cDNA文库进行了筛选。实验经Leu、Trp、His、Ade四种氨基酸营养缺陷型培养基筛选以及β-半乳糖苷酶活性分析,共获得112个阳性克隆,经过反复传代四种氨基酸营养缺陷型培养基筛选和β-半乳糖苷酶活性分析,去除一个酵母菌株中含有两个cDNA文库质粒的可能,再经过回交实验验证,最大程度的保证了酵母双杂交结果的准确性。从酵母菌株中提取质粒,转入大肠杆菌中,以氨苄青霉素（Amp）抗性筛选靶质粒,对部分阳性克隆的插入片段进行测序,在GENE BANK进行比对后分类,从分类结果可知与Myo X相互作用的蛋白涉及参与细胞迁移蛋白、细胞骨架蛋白、参与物质运输蛋白、参与基因表达调节的蛋白、参与信号转导蛋白等,为深入了解Myo X在生理上的新功能奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 酵母双杂交系统原理
• 1.2 酵母双杂交系统的特点
• 1.3 酵母双杂交系统的应用
• 1.4 Myo X 结构特征
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒与菌种
• 2.1.2 化学试剂
• 2.1.3 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 制备酵母感受态细胞
• 2.2.2 小规模转化酵母细胞
• 2.2.3 人胎脑cDNA 文库的滴度测定
• 2.2.4 人胎脑cDNA 文库的扩增
• 2.2.5 酵母大规模转化
• 2.2.6 酵母质粒提取及氯化钙法转化大肠杆菌
• 2.2.7 回交实验确定蛋白质之间特异的相互作用
• 2.2.8 文库质粒cDNA 插入片段的序列分析
• 3 实验结果
• 3.1 诱饵质粒的自激活活性检测
• 3.2 人胎脑cDNA 文库的滴度测定、扩增
• 3.3 酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA 文库
• 3.4 假阳性克隆的排除
• 3.5 阳性克隆的测序结果和同源性比较
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢