棉花叶柄高效再生体系的建立与遗传分析

论文摘要

利用遗传工程技术改良棉花品种已经取得了巨大的经济效益和社会效益。农杆菌介导遗传转化法是棉花的主要遗传转化方法之一,然而目前棉花的生物技术的发展仍然存在着很多障碍,在棉花转基因技术中存在体细胞胚胎发生的基因型依赖性、棉花组织培养的低效性（耗时,耗工）、基因转化技术的复杂性（难重复,转化率低）和转基因棉花的农艺性状的变异等等,这些问题已经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的障碍和瓶颈。本研究针对棉花组织培养中涉及的主要问题,从棉花组织培养外植体的选择、基因型限制的遗传规律、适合组织培养的特种棉花材料选育等方面进行初步研究,同时把棉花农杆菌介导法的遗传转化效率提高了23倍,转基因周期缩短到6个月,转化效率稳定在30%,为棉花功能基因的快速鉴定与转基因材料的创造提供了技术支撑。取得的主要研究结果如下:大田叶柄组织培养体系的建立:通过大田棉株叶柄愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的分化、胚状体的萌发等试验,建立了CCRI24的叶柄组织培养体系,与常用的无菌苗下胚轴组织培养体系相比,该体系培养周期和分化率均无显著差异,其分化率稳定在30%左右。同时解决了叶柄组织培养过程中愈伤组织难以分化为胚性愈伤组织、胚性愈伤组织比来源于无菌苗下胚轴的胚性愈伤组织更容易褐化的问题。①激素对褐化有一定的影响,调节激素的用量,也可以达到早出胚状体的目的KT/6-BA组合中,6-BA的用量应介于0.08～0.16 mg·L-1之间较好,KT的用量在0.08～0.12 mg·L-1效果较好;在KT/IAA组合中,KT在0.080.12mg·L-1时,IAA用量在0.080.12mg·L-1正常胚状体的比例较高②培养基中氮源的配比是棉花新分化的胚性愈伤组织在继代中出现褐化的主要原因,将MS培养基大量元素中KNO3的用量增加到3.04g·L-1,NH4NO3减少到0.66g·L-1有利于防止褐化。棉花叶柄愈伤组织分化率的遗传分析:通过研究发现,叶柄分化率分布符合正态分布,说明叶柄分化率受数量基因控制。利用主-多基因模型分析发现:大田棉花叶柄的分化率主要受2对主基因控制。基因间存在加性、显性、上位性,该性状主基因遗传率在74.68%83.22%。说明利用育种手段可以选育出高分化率的材料。在控制分化率的基因中,也存在多基因效应,多基因解释的遗传变异低,仅有10.47-16.78%。叶柄分化率相关基因的QTLs定位:通过W10×TM-1组合的F2群体分子标记,找到了27个多态性标记,采用Mapmaker/Exp（Version3.0）数据分析软件构建连锁群,进行分子标记的连锁群分析与位点排序,对检测到的19个位点进行分析,有12个位点进入2个连锁群（LOD≥3.0）,两连锁群分别包含5个和7个分子标记。根据连锁群长度从大到小顺序对各连锁群进行命名为LG1、LG2,LG1连锁群长度为194.3cM,LG2连锁群长度为109.1cM,标记间的最小遗传距离为12.7cM,最大的遗传距离为43.3cM。应用复合区间作图法共检测到3个与分化率相关性状的QTL（LOD≥2.5）,分布在2个连锁群上,解析8.4%58.1%的表型变异。其中,1个贡献率达到58.1%。另两个贡献率分别为14.4%和8.4%。棉花叶柄组织培养特性:棉花不同部位的叶柄细胞在脱分化形成愈伤组织方面无显著差异;在棉花植株生长发育的旺盛时期,即蕾期、盛蕾期、开花期、盛花期,植株不同部位、不同发育时期的叶柄愈伤组织的生长速度有一定的差异;胚性愈伤组织分化率没有显著差异。到了棉花生长发育的后期,随着叶柄的衰老程度增加,诱导出的愈伤组织状态发生改变,生长缓慢,但仍有42.8%的分化率。说明叶柄是比较适合组织培养的外植体。棉花叶柄遗传转化体系的建立:叶柄和无菌苗下胚轴对卡那霉素的耐受性不同,在用作遗传转化外植体时抗生素筛选浓度不同,农杆菌浸染和适宜抗生素筛选条件下,抗性愈伤组织的诱导率分别是84.3%和46.7%,而两者抗性愈伤组织分化率分别是65.1%和71.8%,因此叶柄转化率是51.8%,无菌苗下胚轴的转化率是33.5%,利用叶柄作外植体的转化效率是无菌苗下胚轴的1.55倍。叶柄抗性愈伤组织诱导率高的原因也可能与叶柄横截面面积大,与农杆菌接触的细胞多有关。棉花高分化率材料的选育体系的建立与遗传转化:应用叶柄组织培养体系,从CCRI24、冀合312、中394中选育出叶柄分化率≥80%的株系10个,其中有6株系的无菌苗下胚轴分化率也高达100%。选育的株系分化能力可以稳定的遗传给后代,解决了棉花组织培养研究中由于分化率不稳定而使培养体系不稳定的现象。从而建成了一套稳定的棉花组织培养体系。初步利用选育的材料研究发现,棉花愈伤组织诱导培养基可以显著的影响愈伤组织的分化。不同基因型材料对愈伤诱导与分化培养基的激素要求不一样。利用选育的株系及其培养体系进行棉花农杆菌遗传转化,转化效率可以稳定在3040%之间,比CCRI24转化效率提高1.88倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 转基因作物的发展与转基因技术的应用
• 1.2 棉花的主要遗传转化方法
• 1.3 棉花的组织培养的建立及其发展
• 1.3.1 棉花的组织培养的建立
• 1.3.2 棉花组织培养中基因型的拓宽
• 1.4 棉花组织培养体系的研究进展
• 1.4.1 棉种及品种之间体细胞胚发生能力的基因型限制
• 1.4.2 外植体间愈伤组织诱导的差异
• 1.4.3 激素对棉花胚状体发生的影响
• 1.4.4 氮源对体细胞胚发生的影响
• 1.4.5 棉花胚性愈伤组织的褐化
• 1.4.6 其他因素
• 1.5 植物组织培养中基因型限制的遗传研究
• 1.6 体细胞胚胎发生生化机制研究
• 1.6.1 胚性和非胚性愈伤的生化物质差异的分析
• 1.6.2 体细胞胚发生能量代谢动态
• 1.6.3 体细胞胚发生中酶活性及同工酶研究
• 1.6.4 体细胞胚发生的标记性蛋白研究
• 1.6.5 体细胞胚发生中DNA 的代谢研究
• 1.6.6 胚胎发生的mRNA 差别显示与cDNA 克隆
• 1.6.7 胚胎发生的激素动态研究
• 1.7 分子标记研究进展
• 1.7.1 分子标记类型
• 1.7.2 棉花重要农艺性状的QTL 定位
• 1.8 改良新组织培养体系，利用分子技术提高棉花分化率
• 第二章 棉花叶柄组织培养体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 培养基配制
• 2.1.3 棉花叶柄组织培养
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 灭菌处理与愈伤诱导率和污染率的关系
• 2.2.2 叶柄愈伤组织的诱导
• 2.2.3 叶柄愈伤组织的分化培养
• 2.2.4 胚性愈伤组织的增殖与胚状体分化培养
• 2.2.5 胚状体萌发与植株再生试验
• 2.3 本章小结
• 2.3.1 棉花叶柄的灭菌
• 2.3.2 棉花叶柄愈伤组织的诱导
• 2.3.3 胚性愈伤组织的分化
• 2.3.4 叶柄组织培养中的极性现象
• 2.3.5 胚性愈伤组织的继代培养
• 2.3.6 胚状体萌发与植株再生
• 第三章 棉花叶柄分化率主基因与多基因遗传分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 分化率的统计
• 3.1.3 组织培养体系
• 3.1.4 数据遗传分析方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 时代间单株分化能力
• 3.2.2 分化率的正态分布检验与次数分布
• 3.2.3 叶柄分化率的主-多基因模型分析
• 3.3 本章小结
• 3.3.1 叶柄分化率的分布符合数量遗传规律
• 3.3.2 叶柄分化率主-多基因遗传分析结果
• 第四章 W10 叶柄分化率的相关基因分子标记与QTLS 定位
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 DNA 提取
• 4.1.3 标记筛选策略
• 4.1.4 SSR 标记体系
• 4.1.5 SSR 引物
• 4.1.6 数据读取及分析方法
• 4.2 试验结果与分析
• 4.2.1 亲本叶柄分化率的表现
• 4.2.2 分子标记的多态性筛选及标记分离
• 4.2.3 多态性引物的筛选与标记的基因型分析
• 4.2.4 分子标记连锁图谱的构建与QTL 定位
• 4.2.5 分化率相关QTLs 检测
• 4.3 本章小结
• 4.3.1 作图群体
• 4.3.2 棉花遗传连锁图
• 4.3.3 棉花叶柄分化率相关的QTLs 分析
• 第五章 棉花叶柄培养特性与遗传转化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 组织培养体系与培养基
• 5.1.3 外植体准备
• 5.1.4 试验方法
• 5.1.5 目的基因选择
• 5.1.6 转化方法
• 5.1.7 抗生素灭菌处理
• 5.1.8 再生苗的嫁接定植
• 5.1.9 再生苗的鉴定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 棉花不同部位叶柄组织培养的差异
• 5.2.2 叶柄的遗传转化
• 5.2.3 检测
• 5.3 本章小结
• 5.3.1 棉花叶柄组织培养特性
• 5.3.2 叶柄愈伤组织的生长状态
• 5.3.3 棉花叶柄愈伤组织的分化率
• 5.3.4 叶柄组织培养体系在遗传转化中的应用
• 第六章 棉花高分化率材料的选育与遗传转化
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 组织培养技术体系
• 6.1.3 目的基因与质粒载体
• 6.1.4 转基因苗检测
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 叶柄组织培养中的基因型限制
• 6.2.2 叶柄愈伤组织高分化率材料的选育
• 6.2.3 利用选育株系研究激素作用的初步试验
• 6.2.4 高分化率株系W10 的遗传转化
• 6.2.5 转基因植株的获得与检测
• 6.3 本章小结
• 6.3.1 棉花高分化率材料的选育
• 6.3.2 叶柄组织培养体系在高分化率材料选育中的应用
• 6.3.3 组织培养与遗传转化的初步结论
• 6.3.4 高效组织培养体系的建立
• 第七章 结论与讨论
• 7.1 结论
• 7.1.1 建立了棉花叶柄组织培养体系
• 7.1.2 棉花叶柄胚性愈伤组织分化率的遗传规律与分子标记
• 7.1.3 建立了棉花叶柄遗传转化体系
• 7.1.4 建立了棉花高分化率材料选育体系
• 7.2 讨论
• 7.2.1 棉花组织培养外植体的拓展
• 7.2.2 棉花组织培养分化率的遗传研究
• 7.2.3 棉花胚性愈伤组织分化率的分子标记
• 7.2.4 棉花胚性愈伤组织高分化率材料的选育
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介