Fbox～（β-TrCP）-PBF融合蛋白介导PTTG蛋白定向降解及其抑癌效应研究

论文摘要

垂体肿瘤转化基因（Pituitary tumor-transforming gene，PTTG）是一种新近分离出来的在多种肿瘤中表达的原癌基因，与肿瘤的发生、增殖和转移有关。泛素-蛋白酶体途径是细胞内最重要的高效特异蛋白降解途径，利用此途径中的SCFβ-TrCP蛋白降解系统作为人工蛋白敲减体系被认为是有效的选择性降解目标蛋白的手段。本课题通过对F-box蛋白家族中的β-TrCP蛋白进行改造，保留其F-box基序而将其底物蛋白结合区域置换为能特异结合PTTG的PBF，命名为Fboxβ-TrCP-PBF，希望其能特异介导PTTG的降解。将Fboxβ-TrCP-PBF表达质粒转染到COS-7细胞中，通过Western blot方法表明其能在真核细胞内正常表达；通过PTTG-EGFP和Fboxβ-TrCP-PBF表达质粒共转染COS-7，探究Fboxβ-TrCP-PBF对外源PTTG降解的效率和特异性、时间梯度降解率以及泛素-蛋白酶体途径依赖性，结果表明Fboxβ-TrCP-PBF依赖于泛素-蛋白酶体途径能迅速高效地降低外源PTTG蛋白水平：通过Western blot、半定量RT-PCR、细胞计数实验和软琼脂集落形成实验表明Fboxβ-TrCP-PBF能介导HeLa细胞内源PTTG蛋白水平下降，从而引起bFGF mRNA水平的明显下降和VEGF mRNA的轻微下调，并产生了肿瘤抑制效应。此PTTG蛋白敲减技术为肿瘤的治疗提出新的可行的手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 PTTG简介
• 1.2 泛素-蛋白酶体途径
• 1.3 蛋白质敲减技术
• 1.4 绿色荧光蛋白简介与应用
• 1.5 课题的创新点
• 1.6 硕士论文的主要内容
• β-TrCP-PBF、PTTG-EGFP融合蛋白表达质粒及对照质粒的构建'>1.6.1 Fbox^β-TrCP-PBF、PTTG-EGFP融合蛋白表达质粒及对照质粒的构建
• β-TrCP-PBF对外源PTTG降解作用的研究'>1.6.2 Fbox^β-TrCP-PBF对外源PTTG降解作用的研究
• β-TrCP-PBF对内源PTTG的降解作用及引起的抑癌效应'>1.6.3 Fbox^β-TrCP-PBF对内源PTTG的降解作用及引起的抑癌效应
• β-TrCP-PBF、PTTG-EGFP融合蛋白表达质粒及对照质粒的构建'>第2章 Fbox^β-TrCP-PBF、PTTG-EGFP融合蛋白表达质粒及对照质粒的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 细胞
• 2.2.2 菌种
• 2.2.3 质粒
• 2.2.4 主要试剂
• 2.2.5 耗材
• 2.2.6 溶液配制
• 2.2.7 仪器
• 2.2.8 方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 各目标DNA片段的克隆
• β-TrCP-PBF融合蛋白表达质粒的构建'>2.3.2 Fbox^β-TrCP-PBF融合蛋白表达质粒的构建
• 2.3.3 PTTG-EGFP融合蛋白表达质粒的构建
• β-TrCP和PBF表达质粒的构建'>2.3.4 对照用Fbox^β-TrCP和PBF表达质粒的构建
• 2.4 讨论
• β-TrCP-PBF对外源PTTG降解作用的研究'>第3章 Fbox^β-TrCP-PBF对外源PTTG降解作用的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 耗材
• 3.2.3 溶液配制
• 3.2.4 仪器
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 各融合蛋白表达质粒在真核细胞内的表达
• β-TrCP-PBF对外源PTTG的降解效果'>3.3.2 Fbox^β-TrCP-PBF对外源PTTG的降解效果
• β-TrCP-PBF对外源PTTG的时间梯度降解率'>3.3.3 Fbox^β-TrCP-PBF对外源PTTG的时间梯度降解率
• β-TrCP-PBF降解外源PTTG的泛素-蛋白酶体途径依赖性分析'>3.3.4 Fbox^β-TrCP-PBF降解外源PTTG的泛素-蛋白酶体途径依赖性分析
• 3.4 讨论
• β-TrCP-PBF对内源PTTG的降解作用及引起的抑癌效应'>第4章 Fbox^β-TrCP-PBF对内源PTTG的降解作用及引起的抑癌效应
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 耗材
• 4.2.3 溶液配制
• 4.2.4 主要仪器
• 4.2.5 研究方法
• 4.3 实验结果
• β-TrCP-PBF降低HeLa细胞内的PTTG蛋白水平'>4.3.1 Fbox^β-TrCP-PBF降低HeLa细胞内的PTTG蛋白水平
• β-TrCP-PBF对HeLa细胞PTTG、bFGF和EVGF mRNA水平的影响'>4.3.2 Fbox^β-TrCP-PBF对HeLa细胞PTTG、bFGF和EVGF mRNA水平的影响
• β-TrCP-PBF对HeLa细胞生长的抑制'>4.3.3 Fbox^β-TrCP-PBF对HeLa细胞生长的抑制
• β-TrCP-PBF对HeLa细胞非锚着生长的影响'>4.3.4 Fbox^β-TrCP-PBF对HeLa细胞非锚着生长的影响
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表文章目录
• 致谢