论文题目: Smad3/siRNA阻断TGF-β1/Smad3信号转导通路的防治肝纤维化作用研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 药理学
作者: 刘兴君
导师: 王敏伟,殷勤伟
关键词: 肝纤维化,柚皮素
文献来源: 沈阳药科大学
发表年度: 2005
论文摘要: TGF-β1是一个多效性生长因子，在调节细胞外基质(ECM)的生成和器官、组织纤维化的发生、发展过程中发挥重要作用。肝星状细胞(HSCs)是肝内产生ECM的主要细胞，它的激活与活化状态的维持是肝纤维化的发生和发展过程中的重要事件之一，而HSCs的活化和生成ECM是由TGF-β1／Smad3信号通路调控的。大量研究表明，在不同位点、用不同的阻断剂如抗体、竞争性Ⅱ型TGF-β受体、Ⅰ型TGF-β受体(TβR-Ⅰ)的小分子抑制剂、寡义核苷酸或小干扰RNA(siRNA)等阻断TGF-β1／Smad3通路后，体内外均能抑制ECM的过渡生成，并能减轻器官纤维化的程度，但以Smad3蛋白为靶点拮抗TGF-β1／Smad3通路的研究尚无报道。我们首先建立了TGF-β1／Smad3信号通路的虫荧光素酶的报告基因系统，通过TβR-Ⅰ的小分子抑制剂—SB-431542的抑制实验已确认此模型的有效性，并筛选了稳定表达的MvLu1细胞株。通过柚皮素抑制TGF-β1／Smad3的报告基因系统实验，我们首先证明柚皮素是TGF-β1／Smad3通路的拮抗剂；体外实验表明，柚皮素不仅可以抑制TGF-β1诱导的HSCs生成ECM，而且可以明显抑制Smad3的mRNA转录过程。首次证明柚皮素是通过直接或间接抑制Smad3的转录过程而阻断TGF-β1／Smad3信号通路的，其抗纤维化作用也至少部分是通过此作用机制来完成的。由于Smad3位于信号通路的下游、更接近靶基因，同时体内外实验表明Smad3基因敲除可以防治肝、肺等器官纤维化的发生，所以我们设计了siRNA来沉默Smad3基因。通过报告基因与RT-PCR实验，第一次证明Smad3的siRNA可剂量依赖型抑制其基因的表达，并可阻断TGF-β1／Smad3信号通路；同时可在mRNA和蛋白水平抑制TGF-β1诱导的HSCs生成ECM；DMN诱导的大鼠肝纤维化实验表明，siRNA／Smad3能明显增加实验鼠的存活率，增加其体重及肝的重量，能有效降低血清内TGF-β1和ECM组份水平，能明显改善肝功能，能显著降低肝内ECM组份的含量。表明siRNA／Smad3具有防治肝纤维化的作用，可向发展抗纤维化药物的发现进行更深入的研究。
论文目录:
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第一章 绪论
1 TGF-β1／Smad3信号传导途径
1.1 TGF-βs超家族成员与其体内表达及对生物活性的调控
1.2 Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受体的结构与功能
1.3 TGF-β超家族诱导的细胞内信号传导
1.4 Smads蛋白的核内转录活性
1.5 与Smads蛋白结合的转录因子
1.6 Ⅰ-Smads蛋白的功能
1.7 TGF-β不依赖于Smads蛋白的信号转导通路
1.8 TGF-β／Smad3通路与其它信号转导通路的交联
2 肝纤维化发病的分子机制
2.1 细胞外基质的主要成分及其功能特征
2.2 肝纤维化的细胞内组分与ECM之间的相互作用
2.3 纤维化与肝星状细胞
3 肝纤维化的流行病学及治疗方法
3.1 流行病学现状
3.2 治疗方法
4 RNA干扰
5 拮抗TGF-β1／Smad3信号通路对肝纤维化的防治作用
5.1 在纤维化生成与发展过程中TGF-β1维持高水平
5.2 外源性TGF-β1可导致ECM过多积累和纤维化发生
5.3 在不同位点阻断TGF-β1／Smad3信号通路都能防治肝纤维化
6 立题依据
第二章 TGF-β／Smad3信号通路报告基因的建立与稳定细胞克隆的筛选
1 材料与试剂
2 方法与步骤
3 实验结果
3.1 B4-(CAGA)_(12)-pMLP-Luc报告基因的构建
3.2 虫荧光素酶活性测定
4 讨论
第三章 SB-431542和柚皮素对报告基因的阻断作用
1 材料与试剂
2 方法与步骤
3 数据处理及统计方法
4 实验结果
4.1 SB-431542对双报告基因系统的作用结果
4.2 柚皮素对双报告基因系统的作用结果
5 讨论
第四章 Naringenin对TGF-β1／Smad3信号通路的拮抗及对HSC产生ECM的抑制作用
1 材料与试剂
2 方法与步骤
3 统计分析
4 实验结果
4.1 柚皮素对HSCs的细胞毒较低
4.2 柚皮素抑制Smad3的转录及其蛋白表达,而不影响TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ
4.3 柚皮素不影响Smad2、Smad4和Smad7的转录
4.4 柚皮素可在mRNA和蛋白水平同时抑制ECM的表达
5 讨论
第五章 干扰Smad3的siRNA的设计、连接载体及其活性筛选
1 材料与试剂
2 方法与步骤
3 实验结果
3.1 表达S2-siRNA的寡核苷酸双链与载体的连接
3.2 表达S2质粒的筛选
3.3 S2-vector在HSCs内的表达
3.4 裸S2-siRNA对报告基因系统的作用结果
3.5 S2-vector对报告基因系统的作用结果
4 讨论
第六章 SB-431542和siRNA／Smad3对HSC产生细胞外基质的影响
1 材料与试剂
2 方法与步骤
3 实验结果
3.1 SB-431542对TGF-β1诱导的HSCs生成Col Ia1、FN和PAI-1 mRNA的抑制作用
3.2 siRNA／Smad3对TGF-β1诱导的HSCs生成Col Ia1、FN和PAI-1 mRNA的抑制
3.3 siRNA／Smad3对TGF-β1诱导的HSCs生成Smad3、P-Smad3、Col Ia1、FN和PAI-1的抑制
4 讨论
第七章 siRNA／Smad3沉默Smad3基因防治DMN诱导的大鼠肝纤维化的作用研究
1 材料与试剂
2 方法与步骤
3 统计软件及方法
4 实验结果
4.1 肝内红色荧光蛋白的表达
4.2 动物存活率的差异
4.3 肝脏外观上的差异
4.4 肝内结构的变化和组织学评分
4.5 动物体重和肝脏重量的变化、肝内ECM的变化
4.6 血清内TGF-β1水平的变化
4.7 肝功能血清学各项指标的检测结果
4.8 血清内ECM的变化
4.9 肝内Smad3和a-SMA表达量的变化
5 讨论
结论
参考文献
缩略语
发表文章目录
致谢
个人简历
发布时间: 2006-12-14
参考文献
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