黄淮山羊骨形态发生蛋白-4（BMP-4）基因的克隆与表达

论文摘要

为了研究黄淮山羊多胎性状和遗传多样性,开发利用我国地方品种资源以及保护山羊物种多样性,同时为黄淮山羊的品种选育及产业化开发提供依据。本研究克隆BMP-4基因全长编码序列、内含子及启动子,在E.coli中诱导表达成熟肽并对诱导条件进行优化,同时用RT-PCR的方法检测其在黄淮山羊7种组织中的表达含量。通过研究得到如下结论:1结合NCBI数据库已登陆的其他物种BMP-4基因的序列,采用分段扩增的方法,从黄淮山羊的肾组织中克隆到一条长1230bp的完整阅读框（ORF）cDNA序列。本序列已提交NCBI,登录号为:EF632080。对所得到的编码序列进行同源性分析,山羊与绵羊、猪、人、小鼠和牛的相应序列同源性分别为:99.43%、96.10%、94.96%、91.79%、99.19%;表明此基因在各物种间高度保守。其中,与人和小鼠的BMP-4相比,山羊BMP-4编码序列多三个碱基,而山羊与绵羊、牛相应序列的同源性达到了99%以上,暗示山羊和绵羊、牛亲缘关系较其他物种更近。黄淮山羊BMP-4基因全编码序列编码409个氨基酸,其前19个氨基酸为信号肽,后116个氨基酸为成熟肽,中间的274个氨基酸为前肽,蛋白的理论分子量为46.63kDa。氨基酸成熟蛋白区具有BMPs家族的典型特征:七个半胱氨酸残基。与绵羊、猪、人、小鼠和牛的同源性分别为:99.51%、98.53%、97.80%、98.04%、99.51%,这些也说明BMP-4基因是一种在进化上很保守的蛋白质。2通过PCR方法克隆得到了1053bp和962bp的内含子2和3序列,两序列含有内含子的一般特征-“GT-AG”规律,表明得到的序列为内含子的全长序列（NCBI登录号为:EU104684）。经分析发现,猪、人、小鼠和牛内含子2和3序列的相应长度分别为:1028bp、1046bp、1061bp、1062bp和949bp、964bp、1002bp、961bp;山羊BMP-4基因内含子2和3与它们相应序列的同源性分别为:83.80%、76.03%、66.94%、96.71%和87.15%、80.24%、67.20%、98.13%。得到的启动子部分序列长度为:676bp（NCBI登录号为:EU679369）。3将BMP-4成熟肽片段克隆入pET32a原核表达载体,在E.coliBL21（DE3）plysS实现了表达,表达的蛋白大小为31kDa,其中成熟肽为13.1kDa。根据蛋白的表达量对诱导条件进行优化,适宜的诱导条件为:0.5mMIPTG、22℃、诱导8h。参照分子克隆实验指南的方法对重组蛋白进行亚细胞定位,结果显示重组蛋白主要以包涵体的形式存在,胞质和周质中也有少量蛋白表达,而培养液中则没有重组蛋白出现。4通过半定量RT-PCR方法检测了黄淮山羊BMP-4基因7种组织的RNA表达谱,检测结果表明这7种组织中均有BMP-4基因的表达,其中BMP-4基因在肾脏中的表达量最高,其次为脾脏、肝脏和卵巢,而在胰腺、肺脏和心脏中的表达量较低。这个结果说明,BMP-4基因在各组织中的表达具有组织特异性。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一部分 文献综述
• 第一章 文献综述
• 1.1 黄淮山羊种质特性
• 1.2 骨形态发生蛋白-4（BMP-4）研究进展
• 1.2.1 骨形态发生蛋白（BMPs）简介
• 1.2.1.1 BMPs 的种类
• 1.2.1.2 BMPs 的信号转导及调节
• 1.2.1.3 BMPs 及受体的生物学作用
• 1.2.2 BMP-4 的结构特点
• 1.2.2.1 BMP-4 空间结构
• 1.2.2.2 BMP-4 基因克隆与调控
• 1.2.3 BMP-4 生物学特性
• 1.2.3.1 BMP-4 的骨诱导作用
• 1.2.3.2 BMP-4 在动物生殖中的作用
• 1.2.3.3 BMP-4 在胚胎发育中的作用
• 1.2.3.4 BMP-4 与疾病发生
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二部分 实验研究
• 第二章 黄淮山羊骨形态发生蛋白-4（BMP-4）基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验样品
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 试剂盒、菌株及酶
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 试剂配制
• 2.2 方法和步骤
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 BMP-4 全编码序列的扩增
• 2.2.3 内含子2、3 及启动子部分序列的扩增
• 2.2.3.1 基因组DNA 的提取
• 2.2.3.2 内含子2 和3 的PCR 扩增
• 2.2.3.3 启动子部分序列的PCR 扩增
• 2.2.4 PCR 产物的纯化
• 2.2.5 PCR 产物的连接
• 2.2.6 连接产物的转化
• 2.2.6.1 感受态细胞的制备
• 2.2.6.2 连接产物的转化
• 2.2.7 重组体的鉴定
• 2.2.7.1 β-半乳糖苷基因插入失活筛选
• 2.2.7.2 质粒的小量制备
• 2.2.7.3 滞后质粒筛选
• 2.2.7.4 重组质粒的PCR 鉴定
• 2.2.7.5 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.7.6 重组质粒的测序
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 BMP-4 全编码序列的扩增
• 2.3.1.1 肾组织总RNA 的提取
• 2.3.1.2 两片段的PCR 扩增
• 2.3.1.3 重叠PCR 反应
• 2.3.3 内含子2、3 及启动子部分序列的PCR 扩增
• 2.3.3.1 血液基因组DNA 的提取
• 2.3.3.2 内含子2、3 的PCR 扩增
• 2.3.3.3 启动子部分序列的PCR 扩增
• 2.3.4 重组质粒的鉴定
• 2.3.4.1 全长编码序列重组质粒的鉴定
• 2.3.4.2 内含子2 和3 重组质粒的PCR 鉴定
• 2.3.4.3 启动子部分序列重组质粒的PCR 鉴定
• 2.3.5 重组质粒的序列测定及分析
• 2.3.5.1 全编码序列测定及其比较分析
• 2.3.5.2 推导氨基酸序列及分析
• 2.3.5.3 不同物种BMP-4 基因的进化分析
• 2.3.6 内含子2、3 和启动子部分序列的测定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 总RNA 的提取
• 2.4.2 重叠PCR 反应
• 2.4.3 血液基因组DNA 的提取
• 2.4.4 基因克隆
• 2.4.4.1 DNA模板
• 2.4.4.2 T-载体
• 2.4.5 BMP-4 基因序列结构分析
• 第三章 黄淮山羊骨形态发生蛋白-4（BMP-4）基因成熟肽的原核表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 仪器与设备
• 3.1.2 菌种与质粒
• 3.1.3 工具酶及试剂盒
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 溶液配制
• 3.2 方法与步骤
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 BMP-4 成熟肽的PCR 扩增
• 3.2.3 PCR 产物及表达载体pET32a 的纯化
• 3.2.4 纯化PCR 产物和pET32a 表达载体的酶切
• 3.2.5 酶切产物的纯化
• 3.2.6 目的基因与表达载体的连接
• 3.2.7 重组质粒的转化及鉴定
• 3.2.7.1 转化
• 3.2.7.2 鉴定
• 3.2.8 目的蛋白的诱导表达及检测
• 3.2.8.1 目的蛋白的诱导表达
• 3.2.8.2 目的蛋白的检测
• 3.2.9 诱导表达条件的优化
• 3.2.9.1 适宜IPTG 浓度的确定
• 3.2.9.2 适宜诱导温度的确定
• 3.2.9.3 适宜诱导时间的确定
• 3.2.10 目的蛋白的亚细胞定位
• 3.2.11 重组蛋白的提取及纯化
• 3.2.11.1 重组蛋白的提取
• 3.2.11.2 重组蛋白的纯化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 BMP-4 成熟肽序列的PCR 扩增
• 3.3.2 BMP-4 成熟肽诱导表达及条件的优化
• 3.3.2.1 目的蛋白的诱导表达
• 3.3.2.2 诱导条件的优化
• 3.3.3 BMP-4 成熟肽诱导表达蛋白的亚细胞定位
• 3.3.4 BMP-4 成熟肽诱导表达蛋白的纯化
• 3.4 讨论
• 3.4.1 原核表达载体的选择
• 3.4.2 稀有密码子对蛋白表达的影响
• 3.4.3 诱导表达条件的优化
• 3.4.4 糖基化的影响
• 第四章 黄淮山羊骨形态发生蛋白-4（BMP-4）基因组织含量表达的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 试验样品
• 4.1.2 仪器与设备
• 4.1.3 试剂盒、菌株及酶
• 4.1.4 试剂
• 4.1.5 溶液配制
• 4.2 方法与步骤
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 组织总RNA 的提取
• 4.2.3 RNA 电泳（甲醛变性电泳）
• 4.2.3.1 甲醛变性胶的制作
• 4.2.3.2 RNA 模板准备
• 4.2.4 cDNA 第一链的合成
• 4.2.5 各组织cDNA 的PCR 扩增
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 β-actin 和 BMP-4 基因的 PCR 扩增
• 4.3.2 各组织 BMP-4 基因的相对表达量
• 4.4 讨论
• 4.4.1 组织特异性表达研究
• 4.4.2 影响半定量 RT-PCR 的因素
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 导师简介
• 个人简介